细菌常见的生化鉴定

1、细菌鉴定中常见的生理生化反应一、实验目的。1）了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。2）了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。3）了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。二、实验原理。各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存 在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴 别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。糖（醇）类发酵试验原理：不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同， 产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。指示

2、剂漠甲酚紫，pH5.2黄色 pH6.8紫色，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。培养基的制备：操作：编号：在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。接种：取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变 形杆菌，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支 接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。将已接种好的培养基置32C温箱中培养24h。甲基红试验（M,R试验）原理：甲基红试验，pH4.4红色pH6.2黄色，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如 甲酸、乙酸、乳酸等。有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进

3、一步反应形成甲酸、乙酸、 乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下。有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将 有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。甲基红（MR）试剂： 甲基红：0.04g95%的乙醇：60ml 蒸馏水：40ml，先将甲基红溶于95%的乙醇中再加入蒸馏水即可。试剂的制备：葡萄糖蛋白胨水培养基：在100ml邓亨氏蛋白胨水中加入1g葡萄糖即可。步骤：将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，32C培养24h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。Voges-Proskauer试验（伏-普试验，V.P.试验）原理：伏

4、-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。 某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性 条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为V.P反应 阳性。培养基的制备：VP试剂：在100ml蒸馏水中溶解40gNaOH，再加入0.3g肌酐（VP 甲液）即成步骤：将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，32C培养24h，取出，加入40%KOH 7滴，然 后再加入等量的5%a-萘酚溶液，用力振荡，再放入37C温箱中保温30min，以加快反应速 度。若培养物呈现红色，为伏一普反应阳性。靛基质（吲哚）试验原理：某些细菌，如大

5、肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛 基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质培养基的制备：吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛：2g；95%的乙醇：190ml； 浓盐酸：40ml。步骤：将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，32C培养24h后，滴加数滴吲哚试剂于培养物 液面，轻轻摇动，观察结果。出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。硫化氢试验原理：某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形 成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。试剂的制备：醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基：步骤：将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，32C 培养

6、24h，观察结果，若有黑色出现者为阳性。明胶液化实验原理：明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25度以上时明胶就会 液化。有些微生物可产生一种成为明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至 在4度仍能保持液化状态。试剂的制备：明胶培养基：明胶12-15g；普通肉汤：100ml。将明胶加入肉汤中，水浴加热溶解，调pH7.2，分装试管，115C高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。步骤：取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培 养基中，置32C培养24小时。故观察结果时，应将明胶培养基轻轻放入4。冰箱30min， 此时明胶又凝固。若放置于

7、冰箱30min仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。柠檬酸盐利用试验原理：有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生 长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的漠麝香草酚蓝指示 剂pH6.0（黄）7.6（蓝），由绿色变为深蓝色。试剂的制备：柠檬酸盐培养基：步骤：取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，32C培养24h后，观察结果。培养基变 深蓝色者为阳性。淀粉水解实验原理：细菌水解淀粉的过程可以通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。步骤：在培养进表面滴加碘液，观察是否变紫注意：这次实验重点是观察，而且要注意观察前的操作，比如明胶要观察必须先在4C冰箱 冷藏，拿出来后要尽快观察防止其在室温下融化；而吲哚试验要注意不要晃动，因为产生的 玫瑰色靛基质本来就不多，如果剧烈晃动使之扩散开来的话