糖化酶制剂测定方法QBT1803-93

1、湖北立业生物制品有限公司 文件类型 技术文件 批准人 余少文Q/LYTM02-01-16 文件编号 实施日期 2006(10(1糖化酶测定方法1/3 执行部门 质控部 页码1. 试验方法(除酶活力项目外，其它项目按QB/T1803-93标准执行) 1.1 酶活力测定1.1.1 定义1ml液体酶(或1g固体酶粉)，于40?、PH4.6的条件下，1小时分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以u/ml(u/g)表示。1.1.2 原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解,1.4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠，酸化后析

2、出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。1.1.3 试剂和溶液1.1.3.1 乙酸,乙酸钠缓冲溶液 (PH4.6)称取乙酸钠(CHCOONa?3HO)6.7g，溶于水中，加冰乙酸(CHCOOH)2.6ml，用水定容323至1000ml。配好后用PH计校正。1.1.3.2 硫代硫酸钠标准溶液C(NaSO)=0.05mol/L 223a 配制:称取硫代硫酸钠(NaSO5HO)12.4克和碳酸钠0.1克溶于煮沸后冷却的蒸溜223.2水中，定容至1000ml，储于棕色瓶中密闭保存，配制后放置一星期标定使用。b标定:碘酸钾法称取预先在100,105?烘至恒重的分析纯碘酸钾(KIO)3.567克，

3、溶于1000ml蒸馏水3中，即成0.1mol/L碘酸钾溶液。然后吸取10ml于150ml三角瓶中，加入0.5克碘化钾(KI)，溶解后加入1mol/LHSO2ml，用待标定的0.05mol/L NaSO溶液来滴定，滴至淡黄色时，24 223加1%淀粉指示剂2,3滴，继续滴定至无色为终点。c 计算:碘酸钾溶液的摩尔浓度10NaSO 溶液的摩尔浓度= 223消耗NaSO的ml数 2231.1.3.3 碘标准溶液碘溶液C(1/2 I)=0.1mol/L 2a 配制:称取碘化钾(KI)36克溶解在100ml蒸馏水中，再加入碘(I)12.691克溶解2稀释至1000ml贮于棕色瓶。b 标定:用已标定的0.

4、05mol/L NaSO溶液来标定碘溶液。 223吸取10ml待标定的碘液放入250ml碘量瓶中，以0.05mol/L NaSO溶液滴定至淡黄色时，223加入1%淀粉指示剂2,3滴，继续滴定至无色为终点。湖北立业生物制品有限公司 文件类型 技术文件 批准人 余少文Q/LYTM02-01-16 文件编号 实施日期 2006(10(1糖化酶测定方法2/3 执行部门 质控部 页码c 计算:0.05消耗NaSO的ml数 223碘溶液的摩尔浓度= 101.1.3.4 氢氧化钠溶液C(NaOH)=0.1mol/L称取氢氧化钠4g，用水溶解并定容至1000ml。1.1.3.5 200g/L氢氧化钠溶液称取氢

5、氧化钠20g，用水溶解并定容至100ml。1.1.3.6 硫酸溶液C(1/2 HSO)=2mol/L 24量取浓硫酸(密度为1.84)5.6ml，缓缓注入80ml水中，冷却后，定容至100ml。 1.1.3.7 20g/L可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉(以绝干计)2.000g，精确至0.0001g，用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中，加热煮沸2分钟直至完全透明，冷却至室温，全部移入100mL容量瓶，用水稀释至刻度线。此溶液必须当天配制。1.1.3.8 10g/L淀粉指示剂将20g/L可溶性淀粉溶液稀释一倍。1.1.4仪器和设备1.1.4.1 恒温水浴40?0.2?1.1.4.2 秒表

6、1.1.4.3 比色管50ml1.1.5 分析步骤1.1.5.1 待测酶液的制备称取酶粉1,2克，精确至0.002g(或吸取液体酶1.00ml)，先用少量的乙酸钠缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，如此捣研3,4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度(使酶活力在100,250u/ml范围内)，摇匀。供测定用。 1.1.5.2 测定1.1.5.2.1 于甲、乙两支50ml比色管中，分别加入可溶性淀粉溶液25.0ml及缓冲液5.00ml摇匀后，于40?0.2?恒温水浴中预热5min。在甲管(样品)中加入待测酶液2.00ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立即各

7、加200g/L氢氧化钠溶液0.20ml，将两管取出迅速冷却，并于乙管(空白)中补加待测酶液2.00ml。1.1.5.2.2 吸取上述反应液与空白液5.00ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10.0ml，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.0ml，摇匀、密塞，于暗处反应15min。取出，加硫酸溶液2.0ml，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。湖北立业生物制品有限公司 文件类型 技术文件 批准人 余少文Q/LYTM02-01-16 文件编号 实施日期 2006(10(1糖化酶测定方法3/3 执行部门 质控部 页码注:不同的稀释倍数，应做相应的空白试验。1.1.6 计算X=(A-B)C 90.05 32.2/5 1/2 n 2 = 579.9 (A-B)C n式中:X 样品的酶活力，u/g (u/ml);A 空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml;B 样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml;C 硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L;90.05 与1.00ml硫代硫酸钠标准溶液,c(NaSO)= 1.000mol/L, 相当以223克表示的葡萄糖的质量。3