临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术

1、第八章 荧光免疫技术 Fluoroimmunoassay, FIA第八章 荧光免疫技术 Fluoroimmunoassa概念：是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法。方法： 荧光抗体技术(FAT): 用荧光素标记抗体进行抗原定位、定量检测等。荧光免疫技术概念：是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种第一节 荧光免疫试验的组成要素1.荧光：某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。2.产生机制： 基态-能量(波长短的光)-激发态-荧光(波长长的光，光致发光)-基态一、荧光的基本知识化学物质基态吸收能量释放能量：发光激发态第一节

2、荧光免疫试验的组成要素1.荧光：某些物质受到一定3.特点： 即时性(停止供能，荧光现象即止10-710-8s） 4.能量来源：光、化学物质、射线。3.特点：1.发射光谱：固定激发波长，在不同波长下所记 录到的样品发射荧光的相对强度。2.激发光谱：固定发射波长，用不同波长的激发光 激发样品,所记录到的相应的荧光发射强度。3.荧光效率：是指荧光物质将吸收的光能转变成 为荧光的百分率。 荧光效率发射荧光的光量子数(荧光强度)/ 吸收光的光量子数(激发光强度)有关参数取决于荧光色素本身的物理特性1.发射光谱：固定激发波长，在不同波长下所记有关参数取决于荧4.荧光的淬灭： 指荧光物质在某些理化因素作用下

3、，发射荧光减弱甚至消退的现象。原因： (1)紫外光照射长； (2)苯胺、酚、铁、汞、镍等。有利：猝灭剂消除不需要的荧光,如硝基苯 处理有荧光的镜油。 保存：避光、避免与其它化学物质接触4.荧光的淬灭：二、荧光物质(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。1、荧光色素应具备的条件 P87 能与蛋白质共价结合，结合蛋白质后不易解离，而未 与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除 荧光效率高 荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明 结合蛋白质后，不影响蛋白质的生化性质及免疫 学活性，而且标记方法简单、快速，结合物稳 定，易于保存。 安全无毒，不具有附加的抗原性。二、荧光物质(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。

4、1、荧光色2、常用的荧光色素：(1)异硫氰酸荧光素(FITC） 最大吸收光谱: 490-495nm 。最大发射光谱: 520-530nm 。荧光颜色: 黄绿色。应用最广： 人眼对黄绿色较橘色更为敏感。 一般切片等标本中绿色的自发荧光少于红色的，本底低 。缺点：易猝灭2、常用的荧光色素：(2)四乙基罗丹明 (RB200)最大吸收光谱: 570nm 。最大发射光谱: 595-600nm 。荧光颜色: 亮橙、橘红色。应用： 常用于双重标记或对比染色。可作为FITC的补充，但其荧光效率较低。 (2)四乙基罗丹明 (RB200)(3)四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 最大吸收光谱: 550nm 。最

5、大发射光谱: 620nm 。荧光颜色: 橘红色。应用： 常用于双重标记或对比染色； 激发峰和荧光距离较大，易于选择滤光系统。(3)四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) (4)藻红蛋白（ PE）最大吸收光谱: 565nm 。最大发射光谱: 575nm 。荧光颜色: 橙色。应用： 常可作为FITC的补充。(4)藻红蛋白（ PE）(二)其他荧光物质1、镧系螯合物 铕(Eu3+)（应用最广）、 铽(Tb3+) 、铈(Ce3+)的螯合物应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶（对羟基苯乙酸）的底物。应用：酶免

6、疫荧光分析(二)其他荧光物质3、花菁染料 (Cyanine Dyes，Cy2，Cy3，Cy5） 荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。 Cy2比FITC更稳定，荧光强度更大，光稳定性和抗淬灭性更好。 Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更弱。 Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察，因此通常用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。3、花菁染料 (Cyanine Dyes，Cy2，Cy3，C临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术荧光显微镜观察1、荧光显微镜 1）光源：（供能

7、作用）用短波长的光源 提供很强的激发光源高压汞灯：波长不连续：365nm435nm (紫外光或蓝紫光) 只能用作荧光激发光源氙灯 卤素灯光源有一定寿命：标本要集中观察荧光显微镜观察1、荧光显微镜高压汞灯：波长不连续：365n2）滤片系统：激光滤片（exciter filter）： 位置：光源和物镜之间 作用：使短波长的光通过、吸收长波长的光紫外光滤片： UG 通过275nm400nm 阻挡400nm以上的可见光 组织的自发荧光弱,呈灰蓝色蓝紫外光滤片： BG 通过325nm500nm 荧光强度大,适于观察细菌标本; 不适于观察有自发荧光的组织标本2）滤片系统：阻挡滤片（barrier filt

8、er）：吸收滤片或抑制滤片 位置：物镜和目镜之间 作用：使荧光通过(410650nm) 阻断荧光以外的其它光。保护眼睛。OG(橙黄色)：GG(淡绿色)：隔热滤片 位置：灯室聚光器前 作用：阻拦红外线阻挡滤片（barrier filter）：吸收滤片或抑制3）镜头: 需消色差、无荧光4）光路: 透射式：适于观察对光可通透的标本 落射式：适于观察透明度不好及各种活性组织3）镜头: 需消色差、无荧光4）光路:临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术一、抗体要求 纯度高、特异性强、亲和力高、效价高（双扩效价1：32）第二节 荧光抗体的制备一、抗体要求第二节

9、荧光抗体的制备 二、荧光素要求 搅拌法: 用于标记体积大, Pr含量高的Ab溶液。 优点：标记时间短、荧光素用量少（10g FITC/1mg Ig） 缺点：非特异性荧光高逐滴加入FITC溶液搅拌46h离心抗体溶液三、荧光素标记抗体的方法 二、荧光素要求 搅拌法: 用于标记体积大, 透析法：蛋白质含量低，样品体积小。 优点：标记均匀，非特异性荧光低。 缺点：时间长，荧光素用量多TITC抗体溶液FITC标记的抗体溶液反应过夜PBS透析法：蛋白质含量低，样品体积小。 优点： 影响因素温度和时间：pH：8.89.5蛋白含量：20 25mg/mL蛋白为宜荧光素的纯度：不应低于75% 影响因素温度和时间：

10、四、 荧光标记抗体的纯化除去未结合的游离荧光素及其降解产物:减少非特异性染色的来源 透析法、凝胶过滤色谱法去除过度标记和未结合荧光素的抗体： 离子交换层析（搅拌）非特异反应物质的去除：以同一正常组织同种动物其它组织的组织粉预先吸收，使非特异荧光大为减弱。四、 荧光标记抗体的纯化除去未结合的游离荧光素及其降解产物抗体效价(高者特异荧光强，非特异荧光相对减弱) 双扩抗体效价：1：161:32比较理想。抗体特异性:吸收试验、抑制试验荧光素与蛋白质结合比例（F/P）P50 固定标本的荧光抗体：F/P=1.5为主 用于活细胞染色的抗体：F/P=2.4为主五、 标记抗体的鉴定抗体效价(高者特异荧光强，非特

11、异荧光相对减弱)五、 标记抗体六、荧光抗体的保存 低温、避光，防止抗体失活及荧光素的脱落和淬灭六、荧光抗体的保存第二节 免疫荧光试验 荧光抗体(已知Ab) 切片标本(未知Ag) 去除未结合的荧光Ab 荧光显微镜下观察是否有特异荧光第二节 免疫荧光试验（一）标本的制作1、材料：细胞、微生物、组织 要求： 标本片尽量薄，以利于抗原抗体的接触、结合和镜检。 尽可能保持Ag的完整性，并保证在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解、变性或脱落，也不扩散到临近细胞或组织间隙中去。 标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，对有传染性的标本要注意实验室生物安全。（一）标本的制作2、玻片和盖玻片的处理3、制片涂片：细

12、胞、微生物可用此法。 印片：组织标本用此法。 切片：组织标本用此法（目前少用）。2、玻片和盖玻片的处理3、制片4、固定目的：防止细胞或切片从玻片上脱落； 去除防碍抗原抗体结合的类脂； 易于保存。4、固定目的：防止细胞或切片从玻片上脱落；常见的固定方法常见的固定方法1、染色方法（1）直接法：测抗原。 标本片 + 特异荧光抗体（已知）（2）间接法：测抗体、抗原 已知（或未知）抗原固定（制片） 加待测抗体（或已知抗体） 加荧光标记的第二抗体。 （二）荧光抗体染色与结果判断1、染色方法（二）荧光抗体染色与结果判断临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术直接法 优点：方法简便 特异性高 非特异性荧光染

13、色少 缺点：敏感度偏低 检测每一种抗原需制备相应的荧光抗体 应用：病原微生物的快速检测 活检标本的免疫病理检查直接法间接法： 优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可用来检测多种抗原 既可用于检测抗原，也可检测抗体 缺点：易出现非特异性荧光 方法较麻烦 操作时间较长 应用：自身抗体的检测间接法：FITCRB200双标记法（3）双标记染色法FITCRB200双标记法（3）双标记染色法2、非特异性荧光来源：自发荧光 荧光抗体的非特异性荧光色素 抗原不纯 染色方法不当控制：高质量纯化免疫原、免疫血清及 标记后的抗体 在荧光染色时设置对照2、非特异性荧光来源：自发荧光3、各种染色法需设置的对照标本自

14、发荧光对照特异性对照（抑制试验）:标本加未标记的特异性抗 体，再加荧光标记的特异性抗体 荧光抗体对照：适于间接法阳性对照3、各种染色法需设置的对照标本自发荧光对照2、标本观察染色当天观察。特异性荧光强度用“+”表示：（） 无荧光（）极弱的可疑荧光（+）荧光较弱，但清楚可见（+）荧光明亮（+）荧光闪亮2、标本观察直接法检测沙眼衣原体直接法检测沙眼衣原体直接法检测嗜肺军团杆菌直接法检测嗜肺军团杆菌临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术间接法测抗核抗体间接法测抗核抗体荧光抗体技术的优缺点缺点：1.对组织细胞进行微细结构的观察做不到。2.标本不能永久保存，荧光有自然消退现象，需 及时观察并照相。3.有非特异性荧光的干扰优点：1.Ag和Ab的特异性与形态的检查结合在一起。2.能做到快速、敏感、定位。荧光抗体技术的优缺点缺点：优点：第五节 荧光免疫试验的临床应用1. 血清中自身抗体的检测：梅毒螺旋体抗体的检测2. 各种微生物的快速检查和测定3. 寄生虫感染的诊断：在寄生虫感染诊断中，间接免疫荧光试验 （IFAT）是当前公认的最有效的检测疟疾抗体的方法。 4. 白细