青蒿琥酯逆转K562A02细胞对阿霉素耐药性机理的研究

1、青蒿琥酯逆转K562/A02细胞对阿霉素耐药性机理的研究摘要目的：研究青蒿琥酯逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性及其作用机制。要领：以对阿霉素敏感的K562细胞作为比拟，用TT法不雅察在有或无阿霉素存在条件下青蒿琥酯对造就的K562/A02细胞干预48h后的生长按捺环境,流式细胞仪检测100gl-1青蒿琥酯作用48h前后K562/A02细胞P糖卵白Pgp均匀荧光强度FI的强弱,生化要领检测100gl-1青蒿琥酯作用48h前后K562/A02细胞内谷胱甘肽GSH的含量。效果：(1)在不含阿霉素环境下，青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞的I50别离为13.80gl-1和13.62gl-

2、1P0.05，在阿霉素存在环境下，青蒿琥酯对K562/A02细胞按捺作用显着增长P0.01；(2)与K562细胞Pgp的表达比拟,K562/A02细胞Pgp高表达,青蒿琥酯处置惩罚前后K562/A02细胞的FI无差异P0.05；(3)青蒿琥酯处置惩罚后K562/A02细胞内GSH含量较处置惩罚前显着落落P0.05。结论：青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞具有细胞毒作用，且可逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药，其机制大概是通过滋扰细胞内GSHGSH转移酶体系成效的发挥，而非对Pgp表达的影响。关键词青蒿琥酯；多药耐药；K562/A02细胞；谷胱甘肽多药耐药(ultidrugresist

3、ane,DR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物出现耐药的同时,对其他布局差异、作用靶位差异的化疗药物亦产生抗药性，是肿瘤化疗失败和复发的泉源。如今探求低毒、高效的耐药逆转剂已经成为肿瘤治疗研究的标的目的。K562/A02细胞是经阿霉素渐渐诱导、具有DR表型的不变细胞系。我们在研究青蒿琥酯抗肿瘤的历程中创造，K562/A02细胞同K562细胞一样均对青蒿琥酯敏感，而且青蒿琥酯的存在可逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性，其不影响K562/A02细胞Pgp的表达而明显低落K562/A02细胞内谷胱甘肽GSH的含量，现报道如下。1质料和要领11细胞系及细胞造就人红白血病细胞株K562及K562/A02

4、细胞由东南大学临床医学院中央实行室提供。K562细胞接种于含10%小牛血清的RPI1640造就液,K562/A02细胞接种于含2gl-1阿霉素、10%小牛血清的RPI1640造就液,置于37、5%2造就箱中,23d传代1次。1.2重要药物及试剂青蒿琥酯广西桂林制药二厂，批号010901，临用前溶于5的NaH3溶液中，然后用RPI1640造就液稀释；四氮唑蓝TT，Gib公司；二甲基亚砜DS，Siga公司；Pgp单抗(PEUI2美国ulter公司)；GSH测定试剂盒、考马斯亮蓝卵白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。1.3青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞增殖的影响取对数生恒久K562及K

5、562/A02细胞,调细胞浓度为1.0105l-1。青蒿琥酯别离用含10%小牛血清的RPI1640造就液及含2gl-1阿霉素、10%小牛血清的RPI1640造就液稀释,作用终浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.125gl-1。将各浓度青蒿琥酯别离与0.1l造就细胞参加96孔平底造就板中，每组样本设5个复孔。37、5%2饱和湿度下造就48h。在停顿造就前4h每孔参加TT20l(5gl1),继承造就4h后离心10in,弃上清液,参加DS150l，放在平板振荡器上振荡溶解甲10in；将造就板置ELSA酶标仪在570n波优点测每孔的光密度D值并记载。盘算按捺率并使用何尔恩法1盘算半数

6、按捺浓度I50。按捺率1-实行组D比拟组D100。14青蒿琥酯对K562/A02细胞Pgp表达的影响无菌网络对数生恒久的K562及K562/A02细胞,细胞浓度为2106l-1。PBS洗涤,PEUI24避光反响30in,PBS洗涤后重悬,流式细胞仪检测细胞Pgp均匀荧光强度FI，设不加PEUI2组作为自身阴性比拟。K562/A02细胞经100gl-1青蒿琥酯处置惩罚48h后无菌网络，配成浓度为2106l-1的细胞悬液。按上述要领测Pgp的FI。15青蒿琥酯对K562/A02细胞内GSH含量的影响取对数生恒久K562及K562/A02细胞,调细胞浓度为1.0105l-1，分为K562细胞无药组、

7、K562/A02细胞无药组及K562/A02细胞药物100gl-1青蒿琥酯处置惩罚组。造就48h后网络细胞,PBS洗涤后调解细胞数为1106l-1,取2l破裂细胞,离心后留取上清。实行按试剂盒说明书操纵,显色反响后测定吸光度,于595n波优点测定卵白,412n波优点测定GSH含量。实行重复4次。盘算各实行组卵白含量及细胞内GSH含量。16统计学处置惩罚数据用x-s表现，两组间接纳t查验举行明显性阐发。2效果21青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞增殖的影响青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞按捺率见表。在不含阿霉素环境下，青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞的I50别离为13.80

8、gl-1和13.62gl-1P0.05，但是在阿霉素存在环境下，青蒿琥酯对K562/A02细胞的I50为2.64gl-1，差异非常明显P0.01，说明青蒿琥酯可以逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药，两者具有协同性。表1青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞的按捺率22青蒿琥酯对K562/A02细胞Pgp表达的影响在K562细胞的自身阴性比拟组,Pgp的FI为0.1860.135,而在参加PEUI2的K562细胞,Pgp的FI为0.1790.128,两者之间差异无明显性(P0.05)，说明K562细胞膜上没有Pgp表达；参加PEUI2的K562/A02细胞，Pgp的FI为23.0063.4

9、31，与自身阴性比拟组的0.3870.229比拟，差异有明显性(P0.05)，说明K562/A02细胞膜上有Pgp高程度表达，提示Pgp到场了K562/A02的耐药机制。K562/A02参加100gl-1青蒿琥酯处置惩罚后的FI为19.6252.694，与药物处置惩罚前的23.0063.431比拟，差异无显着统计学意义(P0.05)，说明青蒿琥酯对Pgp表达无影响。23青蒿琥酯对K562/A02细胞内GSH含量的影响细胞内GSH含量K562/A02细胞为143.21025.344ggpr-1,K562细胞为69.74016.124ggpr-1，两者比拟，P0.05,差异具有明显性，说明K562

10、/A02细胞耐药与GSH高表达有关。100gl-1青蒿琥酯处置惩罚48h后，K562/A02细胞内GSH含量为65.04010.674ggpr-1，较药物处置惩罚前显着低落(P0.05)。3讨论K562/A02细胞是用渐渐增长造就基中阿霉素浓度创立的一株有不变的典范DR表型的人白血病细胞系，具有Pgp表达阳性、dr1RNA高表达、GSHs转移酶(GST)活性高、拓扑异构酶RNA低表达等生物学特性2。此中dr1/Pgp表达非常增高可敏捷将进入细胞内的药物自动地“泵出细胞外,低落白血病细胞内的药物浓度,无法组成对白血病细胞的有用杀伤而导致DR的产生；GST活性增高，加强了GSH与化疗药物或其氧化应

11、激产物的结合，低落化疗药物细胞毒作用，同时促进药物外排，也低落细胞内药物浓度，因此细胞内GSH含量增高也是多药耐药的机制之一。青蒿素及其衍生物在全天下普及应用于抗疟治疗，对救济和治疗脑型和恶性疟疾发挥着紧张作用，尤其是对多药耐药的难治性疟疾以其快速而明显的疗效和奇特机制而为天下所存眷3。比年来，国表里很多学者45均报道青蒿素及其衍生物具有抗肿瘤的作用。本实行中的青蒿琥酯无论是对K562细胞照旧K562/A02细胞均表现有精良的细胞毒作用，与阿霉素无交织耐药性，而且青蒿琥酯的存在可逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性。本研究中Pgp表达程度测定效果表现,K562细胞无Pgp表达,而K562/

12、A02细胞表现Pgp高表达,提示K562/A02细胞耐药性与dr1基因及其编码的Pgp过表达有关。但在本研究中,当加用100gl-1青蒿琥酯后,K562/A02细胞的Pgp表达水均匀无显着改变,提示青蒿琥酯逆转K562/A02细胞的耐药作用并不是通过直接下调Pgp表达程度而发挥作用。本研究效果表现，耐药的K562/A02细胞内GSH含量高于敏感的K562细胞内GSH含量,提示细胞内GSH含量增高是K562/A02细胞形成DR的机制之一。当加用100gl-1青蒿琥酯后,K562/A02细胞系的GSH含量显着低落，说明青蒿琥酯逆转K562/A02耐药大概与此有关。研究表白6，青蒿素类药物抗疟机制为

13、其使用疟原虫细胞内存在的铁离子，催化裂解其分子布局中的过氧桥产生含碳自由基，该自由基烷基化细胞内卵白，使其丧失成效，从而到达杀灭疟原虫的目的。据此推测青蒿琥酯逆转耐药的大概机制为其滋扰了细胞内GSHGST体系成效的发挥，导致细胞内阿霉素浓度增长，规复阿霉素的细胞毒作用。关于此点有待进一步研究证实。参考文献1周立国.药物毒理学.武汉:湖北科学技能出书社，2001：3338.2BALINTGA.Arteisininanditsderivatives:aniprtantnelassfantialarialagentsJ.PharalTher,2001,90:261265.3YANGZ,LUANFJ,XINGDS,etal.ultidrugresistaneinleukeielllineK562/A02induedbydxrubiinJ.中国药理学报,1995,16(4)：333337.4苗立云，张祖贻.青蒿琥酯选择性抗肺腺癌细胞的作用及其机制J.当代医学，2022，