绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用课件

1、绿色荧光蛋白(GFP )技术在细胞生物学研究中的应用 荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞亚门的动物和几乎所有栉水母类的动物在受到刺激时都可以发出荧光：刺胞亚门的动物多发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，它的发现和应用被称为细胞生物学上的一次革命。这种蛋白质结构很特殊，在受到蓝光或紫外线刺激时可以发射绿色荧光，并不需要任何协同因子、底物，适合用作普遍的报告标记，尤其适合于活体细胞或组织。由于GFP稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性, 检测简单，

2、结果真实可靠，是一种独特的报告蛋白(Reporter protein) 。可广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化, 以及细胞的分离与纯化等研究领域。 图1 绿色荧光蛋白 一、GFP的结构 图2 绿色荧光蛋白结构 GFP编码238个氨基酸的多肽单体，只有完整的GFP 分子才会产生生物荧光，被切断的GFP(即使是C、N 末端的少数几个氨基酸)亦能导致GFP 失去发光能力6。与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为荧光生色团(Chromophore)的部位7。在GFP 的初级氨基酸序列上，第6567 个氨基酸(Ser-Tyr-Gty) 形成环状三肽，以

3、共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连。生色团的形成不受种属的限制，其通过细胞内广泛存在的成分的作用或通过自催化作用都能产生。荧光生色团非常稳定, 不易变性, 用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。但是当pH 值恢复到中性或者移去变性物时，它的荧光又会恢复到变性前的水平。GFP 的生色团之间是通过共价键结合。生色团形成的机理目前尚不清楚，但在有分子氧存在的条件下，酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸，并环化形成六肽，这可能是形成色基的必然过程。8 二、GFP 的应用特点1 易于检测GFP荧光反应不需外加任何反应底物，酶或其它共反应因子, 也就不存在这些物质可能难于进入细胞的问题，只需紫外光或蓝光激发, 即

4、可发出绿色荧光，GFP发射的荧光用肉眼或荧光显微镜就可以检测到。灵敏度高, 对于单细胞水平的表达也可识别, 同时还可利用其进行定量检测。由于GFP 对活细胞基本无毒害, 因此无须特殊处理就可以很方便地进行活体观察。而且，具有不同光谱特性的GFP突变体的获得,使在同一细胞中同时分析两种不同蛋白或启动子成为可能,可以用于发育细胞学、药物筛选、分析诊断等研究。这就使GFP有可能成为一种快速、简便、经济的标记蛋白，GFP基因作为报道基因可能有广泛的用途。2 荧光稳定GFP无光漂白现象，在很大的pH 范围内(pH712)都可以正常发出荧光，受温度的影响也很小，只有在超过65时才会变性，荧光消失。荧光显微

5、镜强光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强9。特别在450490 nm蓝光波长下更稳定,但在340390 nm或395440 nm范围内，仍会发生光漂白现象。对于长时间光照，GFP也有很好的耐受性，根据Sheen 等的研究，GFP在受体内表达时可以持续得到不低于10分钟的荧光。4 易于载体构建由于GFP 较小，只含有238 个氨基酸，编码GFP 的基因序列也较短，约2.6kb，所以它可以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。尽管野生型的GFP在某些植物和动物中表达很弱，但可通过更换GFP生色团氨基酸、改变碱

6、基组分、除去内含子、更换强启动子等方法加强表达。Connack 等筛选出了三种含Ser65 突变的突变体，在大肠杆菌中表达时，荧光强度比野生型高约100倍。三、GFP在细胞生物学研究中的应用1 对细胞生理过程的监控在过去的几年中，通过随机和人工诱变得到了许多不同颜色的GFP突变体。通过基因操作，许多蛋白都成功的与GFP进行了融合，通过这些融合蛋白就可以对相应蛋白的表达和转运及生理反应进行监控。目前GFP融合蛋白对细胞内迅速的生理反应的报告大概有三种方式：转移和定位、GFP光谱的生化修饰、荧光共振的能量转移(FRET)。Shen10等在培养的神经元中发现，细胞内的Ca2+瞬间变化就会引起GFP标

7、记的钙调蛋白激酶(CaM K)可逆地易位到突触后膜的densities上。Shi11等用GFP标记来监控-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)的受体，发现它会从细胞内膜转移到树突棘的表面，根据突触中AMPA受体的含量可以解释突触沉默、活化的原因和机制。Siegel12等将野生型的GFP插人Shake K十通道的特殊部位，形成一个异源嵌合体，这个嵌合体发出的荧光将会随着细胞的去极化作用而缓慢的减少。相反，Yanagawa13等将-内酰胺酶插人GFP得到了一个融合体，当此融合体与-内酰胺酶抑制肽(BLIP)结合时,它的荧光发射量会大大增加。3 细胞亚结构及蛋白质分子的定位对于许多蛋白质来说，易位是它们激

8、活机制中的一部分。以前多是用细胞分级分离和免疫细胞化学的技术进行研究，而现在利用GFP融合蛋白的显像技术无疑是一种简便而可靠的检测方法，我们不仅可以更快地而且可以更全面地对蛋白质的移动进行研究。近几年,在GFP技术的进步中最重要的就是对几个GFP突变体的鉴定。通过标准的荧光显微镜，根据它们所发出的不同颜色的荧光，就可以在活细胞中同时而准确的区分多种不同的荧光融合蛋白以及了解它们的分布情况17。在实际中，常用蓝绿色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)两种突变体的组合来在活细胞中进行双色显示。而其他的突变体如蓝色荧光蛋白(BFP)和红色荧光蛋白(RFP)的使用还受到许多限制，因为它们有很快的

9、光漂白作用或者是发射的荧光强度太低。最近又发现GFP 是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子, 可以跟踪观测第二信使, 如Ca2+和cAMP 水平的起伏变化, 细胞间隙pH 值的变化等18。4 用于细胞内蛋白质的动力学研究研究细胞内蛋白质相互作用的技术主要有两种：光漂白荧光恢复法(FRAP)、光漂白荧光损失法(FLIP)。FRAP主要是通过对细胞内特定的点或区域进行强烈的光照，使荧光发生光漂白作用，再通过相同时间间隔的光影像采样记录下荧光恢复的动力学过程。FRAP不仅可以确定细胞器上的蛋白，还可以确定流动蛋白的滞留时间。转录、m-RNA前体的剪切、DNA的修复中蛋白质复合体操作机制都可以用这

10、种方法来研究。FLIP是对细胞的一个区域进行持续性的光漂白，再对光漂白区外的荧光的损失进行监控就可以获得一些标记蛋白之间的相关性信息。目前正在体外通过改变光照点的大小和固定细胞来研究光漂白作用的可逆性，不过还是与活细胞的环境有一定的差距。另外一种可以用来研究细胞内反应动力学的方法就是荧光相关性分光光镜检查(FCS)。这种方法是首先通过聚焦照射在细胞内形成一个一定大小的光洞，光洞中荧光探针的移动会引起荧光的波动，通过校正计算出荧光颗粒的平均滞留时间和平均数量，再根据已知光洞的大小和平均光滞留时间就可以计算出扩散蛋白的动力学参数19。5 计算细胞生长速度在高水平组合型表达GFP 的细胞品系中, 在

11、细胞生长的对数期, 绿色荧光蛋白所发出的荧光信号与细胞的数量密切相关。测量到的任何荧光强度都可以相应地转变成细胞浓度。尽管在细胞生长的后期, 用荧光信号计算得到的细胞数目略低于培养物中的实际数目。但在常用的台盼蓝计数方法中, 这个误差是允许的。利用这一技术, 可以测定某些细胞的分布和生长状况, 尤其是一些透明的动物和植物组织内特定细胞、化合物的生长、分布情况。也有人用此项技术进行病毒在植物体内的生长、扩散情况的研究, 取得了不错的效果。6.观察细胞内酶的活动GFP突变子不仅仅可以用来探测融合蛋白的空间定位，而且可以对活细胞的酶活动，如：磷酸化作用、蛋白水解作用等进行报告，还可以测量与酶活动相关

12、的细胞内的pH、cAMP、Ca2+浓度。通过将外源序列插人GFP基因中，可以对细胞内酶的活动进行观察以及了解这些酶的生理学参数。插入外源基因后所表达的融合蛋白中的GFP蛋白发色基团会发生构像改变，其发射的荧光的强度也会发生很大的变化。这些指示剂可以用来检测细胞内许多酶的作用，例如：蛋白水解酶、激酶、氧化还原酶以及一些小配基的浓度20。7 用于细胞示踪实验研究利用GFP的荧光可以清楚地对肿瘤细胞的生长和转移进行追踪。体内肿瘤侵袭的研究要求在周围正常细胞背景下，能识别少量甚至是单个的瘤细胞。以往用抗肿瘤细胞特异性抗原、抗体进行免疫组化分析，操作较为复杂,且对抗原性有较高要求。利用半乳糖昔酶(Lac

13、 Z)作为标记基因转染肿瘤细胞，操作较为复杂，且需底物分子。而用GFP就可以准确而简便地对肿瘤细胞进行示踪。李侠【21】等将携有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的pEGFP-N3质粒体外转染C6胶质瘤细胞，筛选稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆，以立体定向法植入SD大鼠脑实质内建立大鼠移植瘤模型。4周后处死大鼠并作鼠脑连续石蜡切片,相邻的切片分别做苏木素-伊红(HE)或免疫组化染色后荧光显微镜下检测。在荧光显微镜很容易区分肿瘤区和非肿瘤区，并能发现侵袭至远处的单个肿瘤细胞，其敏感性和特异性明显优于HE染色和免疫组化方法。朱君明22等将GFP和HTH1双基因的多基因表达载体GC-GFP-P-HTH

14、1-SN转染NIH-3 T3细胞，且移植人Parkinon病模型大鼠纹状体内后，也清晰地观察到了NIH-3 T3细胞在脑内的生长情况。Xin23等将EGFP转人EG4细胞(一种原胚细胞)中，建立了几株既可以表达绿色荧光蛋白又依然保持了多能干细胞特征的EG4-GFP细胞系，通过对聚集的EG4-GFP细胞到8细胞胚胎的研究,可以追踪到EG4-GFP细胞在体外分化情况以及在胚胎发育中的命运。9.定量分析GFP的荧光强度很高，很容易用仪器定量检测，而且研究表明GFP的荧光强度和与其相连的细胞或蛋白有一定的相关性，只需要做出一条相关性曲线，就可以对研究对象进行定量的分析。Hack19等将用GFP标记的神

15、经元特异性钙调蛋白calretinin(CR)基因转人畸胎癌细胞中，通过对微血管中GFP荧光的测量，再做出GFP和CR含量的标准曲线来计算出CR的表达量。Mcore25等将GFP在体外转染9L胶质细胞瘤细胞后接种于Fisher大鼠脑内，2周后处死大鼠，进行鼠脑标本切片和荧光显微镜观测，无荧光标记的暗区(blackspots)为肿瘤血管区，由此可计数新生血管数量。10 GFP报告蛋白用于细胞活体分离与纯化利用细胞表面标记，通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪(FACS)，可以分离与纯化特殊类型细胞，对分析cDNA文库、研究基因的细胞发育或组织专一性表达十分重要26,27。利用GFP融合蛋白

16、为细胞表面活体荧光标记，通过筛选已经获得GFP表达的大肠杆菌、人体肾细胞和猿猴COS-1细胞特殊类型。Sheen J等在GFP转染玉米原生质体的流体参数分析中发现，转染1518小时后，对照中只有一类细胞丛，表现较强红色荧光和微弱的绿色荧光，并且细胞间荧光强度相当一致，没有明显差异。而GFP转染的原生质体中出现两类细胞丛，第一类与对照相似，呈现红色荧光，约占细胞总数66.3%；第二类细胞丛呈现绿色荧光，荧光强度是对照的74倍。因此，用流式细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪(Epics Elite, Conlter Electronics,Miami FL, USA)很容易将两类细胞分离开来。原生

17、质体可以来源于不同类型的组织细胞原生质体表达的GFP信息，即可代表某种组织的信息。采用发育专一性启动子构建GFP表达载体，可以将这些具有基因表达特异性的细胞类型分离出来。利用不同表达文库转染原生质体，通过流体参数分析和细胞分类，可以揭示在信号传导途径中所包含的许多反方活化因子(trans-activating fectors)。GFP在生物学和分子生物学研究中的利用还不仅仅局限于上述几个方面。随着研究的深入开展，其广泛利用的潜力将不断表现出来。 参考文献1 Shimomura O, Jhson FH, Saiga Y, et al.,1962,J.Cell.Comp. Physiol, 59:

18、223.2Prasher D, Eckenrode V, Ward W, et al.,1992, Gene, 111:229-233.3Chalfiee M, Tu Y, Euskirchen G, et al .,1994, Science, 263: 802-805.4 Wachter R M and Remington SJ.,1999, Curr, Biol ,9:R628-R629.5Siemering KR, Golbik R, SverR, Haseloff J.,1996, Curr Biol, 6:1653-1663.6 Li X,Zhang G,Ngo N,et al.

19、Deletions of the Aequorea victoria green fluorescent protein define the minimal domain required for fluorescenceJ. J Biol Chem, 1997, 272( 45) : 28545- 28549.7 Morise H, Shimomura O, Johnson FH,et al. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea J. Biochemistry, 1974, 13(

20、12) : 2656- 2662.8 Delagrave S, Youvan DC. Searching sequence space to engineer proteins: Exponential ensemble mutagenesisJ. Bio/Technology, 1993( 11) : 1548-1552.9Nicola J and Hack. 1995,Journal of Neuroscience Methods,177-184.10Shen K and Mever T. 1999,Sience, 284:162-166.11Shi SH , Hayashi Y, Pet

21、ralia RS, et al.,1999,Science,284:1811-1816.12Sigel MS and Isacoff EY., 1997, Neuron, 19:735-741.13Doi N and Yanagawa H.,1999, FEBS Lett, 453:305-307 14Yuk IHY,Wildt S,Jolicoeur M,et al.A GFP- based screen for growth arrested, recombinant protein - producing cells J.Biotechnol Bioeng, 2002(79):74- 8

22、2.15 Strebel A, Harr T, Bachmann F, et al. Green fluorescent protein as a novel tool to measure apoptosis and necrosis J.Cytometry, 2001( 43) : 126- 133.16 Sheen J, Hwang S, Niwa Y, et al. Green fluorescenet protein as a new vital marker in plant cellsJ. The Plant Journal, 1995(8) : 777- 784.17Ellen

23、berg J, et al., 1999, Trends Cell Biol., 9:52-56.18Albano CR, Lu CH, Bentley WE, et al. High throughput studies of gene expression using green fluorescent proteinoxidative tress promoter probe constructs- the potential for living chipsJ. J Biomol Screening, 2001( 6) : 421- 428.19Rigler R, et al.,1993, Eur. Biophys, 22:169一175.20Baird G S, et al., 1999,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:11241