雪旺细胞构建人工神经在大鼠长段 神经缺损中的修复作用研究

1、雪旺细胞构建人工神经在大鼠长段 神经缺损中的修复作用研究【摘要】研究雪旺细胞与PLGA构成的组织工程化人工神经修复大鼠周围神经缺损的效果。方法将雪旺细胞接种在内置plyglatin910纤维的PLGA中空管，构建成组织工程人工神经。将60只SD大鼠随机分3组，每组20只，建立大鼠坐骨神经缺损20的动物模型。A组用切下的自体神经段原位缝合，B组使用雪旺细胞组织工程人工神经进展修复，组用未接种雪旺细胞的PLGA中空管进展修复。术后8、12周使用神经电生理和组织学观察分别进展效果评价。结果在大体观察、组织学观察中，B组的恢复表现与A组相近。在神经电生理检测、小腿三头肌肌肉重量测定、桥接物横切面神经纤

2、维数量测定的结果分析中B组略低于A组但明显高于组。B组大鼠桥接段远端辣根过氧化酶示踪后在脊髓前角可以看到被标记的神经元。透射电镜可见B组桥接物中段大量的再生神经纤维。结论用雪旺细胞和PLGA构建组织工程人工神经修复大鼠外周神经缺损，可以修复20的长段周围神经缺损，并可获得接近于大鼠自体神经修复的效果。【关键词】人工神经长段缺损神经修复Abstrat：bjetiveTstudytheeffetfrepairingfratperipheralnervedefetithengineeringartifiialnervepsedithShannellsandplylatiglyliaed(PLGA).

3、ethdHuanShannellserevainatedintPLGAtubeithplyglatin910.SixtySDratseredividedint3grupsrandlyith20ratsineahne:grupA,self-nervegraft;grupB,Shannellsartifiialnerve;grup,purePLGA.Evaluatinsfeletrphysilgialandhistlgialexaineserearriedut8eeksad12eeksafterperatin.ResultTheutefgrupBshedsiilartgrupAingenerala

4、ndhistlgialstudy,heveritexpressedslightlylerineletrphysilgialstudy,usleEightandnervefiberquantity.arkedneurnuldbefundinspinalrdaftergrupBhadbeentraed.Largenuberfregeneratinnervefibersuldbeseenfreletrnirspe.nlusinThetissueengineeringartifiialnervepsedithShannellsisabletrepair20defetsfperipheralnerve,

5、andithasanapprxiatetreatenteffetttheself-nervegrafting.Keyrds：artifiialnerve;lngdefet;nerveregeneratin人工神经是由支架材料和种子细胞、细胞外基质以及诱导和促进生长的因子等几局部组成的有机统一体，在外周神经损伤修复中有重要的研究意义。雪旺细胞(Shannell)是其中最重要的种子细胞。经培养和纯化后的雪旺细胞在支架内类似于Bungner带样有序分布，并且分泌多种神经营养因子，支持引导轴突的再生，是进步修复神经缺损效果的关键1,2。目前国内外多用新生鼠、兔等动物的周围神经原代培养雪旺细胞构建人工神

6、经。本实验采用内置plyglatin910的聚羟基乙酸-聚乳酸(PLGA)导管制备三维多孔支架，通过接种人胚雪旺细胞，经体外诱导培养，构建人工神经，并桥接于大鼠坐骨神经缺损处，与自体神经移植作对照，研究并评估其对大鼠外周神经修复的效果。1材料与方法1.1主要试剂、材料和仪器plyglatin910(聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物纤维，美国强生公司)；PLGA导管(聚乳酸聚羟基乙酸共聚体，中国科学院)；抗S-100单克隆抗体(Siga公司)；20胎牛血清DE(Giba公司)；鼠尾胶(自制)；0.1gL盐酸氯胺酮注射液；2040gL辣根过氧化酶液；DAB-H22作用液；3,3-二甲基联苯胺(DAB)5g

7、，0.05l/LTris-HL缓冲液(pH值7.6)10L，H22(30)1l。引产34个月婴儿死胎6个；3个月龄SD大鼠32只，体重200250g；SXP-1B手术显微镜；LEIa冰冻切片机；LeiaDIRB图像分析仪。1.2组织工程人工神经的制备1.2.1取胎儿外周神经，仔细剥离神经外膜，剪成0.513小块，置于3.5培养皿中，使用反复植块法和差速贴壁法获得纯度较高的雪旺细胞悬液，细胞数量约在5104。1.2.2将鼠尾胶包埋plyglatin910纤维(直径12，长度2)，置入培养皿中，每1012根纤维中心互相重叠呈放射状排列。使用直接植块法将人胚雪旺细胞接种于plyglatin910纤维

8、上。20胎牛血清DE，37、52培养，备用。1.2.3将20长度的PLGA导管预涂鼠尾胶后参加雪旺细胞悬液。37、52培养2周后，移入plyglatin910纤维，构建成人工神经导管，继续培养2d，准备植入。1.3动物实验将60只SD大鼠随机分3组，每组20只。A组用自体神经段原位缝合；B组用组织工程人工神经修复；组用无雪旺细胞的PLGA中空管。腹腔注射氯胺酮200gkg麻醉大鼠，常规消毒铺洞巾后作股后侧切口，暴露坐骨神经，显微尺测量下切除坐骨神经18，自然回缩后造成20的神经缺损。远侧断端距腓肠肌边缘约5，用10的带针缝线在10倍手术显微镜下，将桥接物与两侧神经断端的外膜缝合。关闭伤口，按实

9、验动物标准饲养12周。术后第8周各组随机取10只大鼠进展观察，第12周对各组剩下10只大鼠进展观察。1.4统计分析采用SPSS12.0软件对实验中各组数据进展分析，P0.05时认为差异有显著性。2结果2.1一般观察术后观察伤口愈合情况、大鼠的精神状态、步态以及足部溃疡情况等。术后1周伤口根本愈合，各组大鼠均出现明显跛行。2周时各组大鼠均出现患肢足跟溃疡。12周时，A、B组大鼠患肢足跟溃疡根本愈合，但患肢仍跛行；组患肢足跟溃疡未愈合，患肢肌肉明显萎缩。2.2植入物观察第8、12周时，切开伤口进展观察。发现各组大鼠取材神经干呈乳白色连接远端神经，没有发现吻合口的断裂。A、B组再生神经直径较粗，神经

10、近端未见神经瘤形成，外表可见明晰的血管，同周围组织均有黏连，但可以别离。B组PLGA管已根本降解。组近端增粗，远段略塌陷，与周围肌肉组织轻度黏连，PLGA导管几乎完全降解吸收，神经没有长入远端。2.3神经电生理检测采用EsateBiediaPhasis肌电测定系统，输出电刺激为单脉冲方波，电压25V，时间0.010.02s。用2个双极保护电极作为刺激电极分别作用于桥接段的近侧端和远侧端，以圆心针单极电极插入腓肠肌肌腹中部，记录再生神经混合传导速度(s)、复合动作电位峰值(V)。术后第8、12周，A、B组都有神经传导通过，在吻合口的远端都可以记录到肌电图，肌电图测量2组传导速度和动作电位的振幅都

11、较对侧正常神经有所下降。组不能引出神经再生的动作电位，只有大量的失神经电位。术后第8、12周各组电生理检测的结果分别列在表1、2，与A组相比，B组神经传导速度较慢，复合动作电位的峰值较低，两组间的差异有显著性(P0.05)表1术后第8周各组动物电生理检测2.4辣根过氧化酶示踪术后12周，再次手术暴露出坐骨神经和人工神经移植段，在人工神经桥接段的远端1的神经干内注射30的游离辣根过氧化酶液1l，继续饲养48h后，在深度麻醉下经心脏灌注4多聚甲醛固定，取出L4、5脊髓，做冰冻切片，片厚40，用TB(3，3，5，5，-四甲基联苯胺)呈色，中性红复染，光镜下观察背根神经节和脊髓前角神经元，在同侧脊髓前

12、角可以看到HRP标记的呈棕色的神经元(图1)。2.5小腿三头肌肌肉测量术后第8、12周取大鼠术侧小腿三头肌，汲取血迹，在分析天平上称肌肉重量。各组大鼠小腿三头肌肌肉较健侧明显萎缩，平均肌肉重量A组高于B组，B组高于组，且差异有显著性(P0.05)(表3)。表3术后各组大鼠小腿三头肌重量的比2.6组织学观察术后第8、12周，在显微镜下取出桥接物。分别选择近侧吻合口段、桥接体中段、远侧吻合口段取材，横向连续切片，作HE染色和甲苯胺兰染色，光镜下观察神经再生和髓鞘形成情况。普通光镜下，近端吻合口各组均有再生神经纤维通过，A组再生神经纤维排列致密，髓鞘明晰可见；B组再生神经排列较为整齐，呈束状，可见丰

13、富的新生血管穿插于其间；组再生神经纤维较为杂乱，有较多的纤维组织增生。在桥接体中段，A组再生神经排列整齐；B组再生神经束较稀疏，但未见瘢痕形成或淋巴细胞侵润；组再生神经纤维杂乱无章在远端吻合口，A、B2组仍有较多的再生神经纤维通过(图2)；组那么没有。B、2组近、中、远三段均未见有plyglatin910纤维残留。2.7图像分析将术后12周各组甲苯胺兰染色切片(图3)置于图像分析仪的显微镜下，采用LeiaQin2.8图像分析系统，对桥接体中段进展测量分析，统计中段的再生神经纤维数目、再生神经束面积及神经纤维密度列于(表4)。图像分析显示B组再生神经中段在再生神经纤维数目与神经纤维密度两方面计数

14、均少于A组，差异有显著性(P0.05)。移植段中点再生神经纤维的面积B组要大于A组(P0.05)。组在再生神经纤维数目与再生神经束面积两方面均明显低于A、B2组，差异有显著性(P0.05)。这与光镜下HE染色切片观察到神经再生情况相吻合。表4术后12周各组桥接物中段横切面图像分析2.8透射电镜观察图1B组大鼠脊髓前角HRP标记的神经元200图2B组远端吻合口HE100图3B组中段甲苯胺兰染色400图4B组再生神经纤维周围有雪旺细胞围绕100003讨论Aguay等1979年首先将体外培养的乳鼠雪旺细胞种植到5长的血管段中，用于桥接大鼠坐骨神经缺损，6周后发现有大量再生神经纤维，为组织工程人工神经

15、的研究奠定了基矗转贴于论文联盟.ll.2002年Evans等3用左旋聚乳酸导管种植同种异体的雪旺细胞修复大鼠12神经缺损，2、4个月时检测神经修复的各项指标和同源雪旺细胞移植疗效相当，但是比自体神经移植效果略差。同年sahebi等4用聚羟基丁酸戊酯导管种植同种异体雪旺细胞，发如今6周时同种异体雪旺细胞受到排挤，但神经轴突的长入情况与同源细胞移植相似，并且没有导致有害的免疫反响。国内，2002年程飚5将成年兔雪旺细胞种植在医用生物膜和plyglatin910纤维上，桥接2.5长坐骨神经缺损，表现出与自体神经移植相当的疗效。2002年顾晓松等用壳聚糖套管和聚乙醇酸纤维制成人工组织神经移植物，辅加促

16、神经生长的中药有效组分，成功修复大鼠10坐骨神经缺损。虽然大量动物实验显示用神经导管能有效修复短间隔 神经缺损7，但目前还没有一种可以在临床上代替自体神经移植。受神经趋化和接触引导的限制，人工神经桥接的间隔 一般不超过30，而临床上面临的主要问题是长段缺损时自体神经的来源缺乏8。通过转基因技术，增强人工神经所负载的雪旺细胞的功能，有希望增加桥接的间隔 。1998年enEi等发现经基因改进能分泌人BDNF的雪旺细胞可促进大鼠神经的轴突再生。冯世庆等10用脂质体转染法将含NGF和BDNF表达基因的质粒导入雪旺细胞，4周后神经营养因子的表达明显增加。电镜下可见到转染后的雪旺细胞内含丰富的粗面内质网和

17、线粒体。陈礼刚等11证实转有pSVPat微基因的雪旺细胞能稳定分泌21.5KuBP。Jung12等用腺病毒转染laz基因到雪旺细胞上，基因持续表达5周以上。但是转基因技术的应用，要充分考虑到可能产生的不良后果。国内张琪13等曾将成人副神经埋于裸鼠皮下模拟瓦氏变性处理，体外培养成功获得人雪旺细胞。另一方面利用大鼠自体雪旺细胞构建人工神经的实验14也得到成功。本实验采用引产死胎外周神经作为雪旺细胞来源。34个月胎龄时，神经系统发育尚不充分，髓鞘尚未成熟，接种后雪旺细胞量大且容易生长。且胚胎神经材料与成人神经相比，所含结缔组织成分较少，神经外膜更易剥离。本实验中将plyglatin910纤维植入PL

18、GA可降解导管中，构建雪旺细胞的三维生长空间，有利于细胞和周围物质之间的交换，促进其分裂增殖。在评估神经再生情况时，除使用电生理方法外，同时通过活体肢体功能观察、靶器官肌肉测量以及辣根过氧化物酶示踪来综合判断损伤神经修复后靶器官的功能恢复情况。这样评估能较全面的对电生理的结果进展补充支持，防止仅用电生理评估造成的偏向。受损神经修复再生时，许多小轴突常常在通过吻合口后就中止于微神经瘤，这就会使再生神经横断面图像分析的结果与实际功能的恢复程度不一致。本实验分别选择近侧吻合口段、桥接体中段、远侧吻合口段取材，切片染色后，光镜下观察神经再生和髓鞘形成情况。并对再生神经的纤维数目、再生神经束面积以及有髓

19、神经纤维密度进展统计学分析，能较全面的评价神经再生的效果。从本实验结果可以看出：在修复大鼠外周神经缺损中，人胚雪旺细胞人工神经的修复效果与大鼠自体神经移植相近，且明显高于空白管对照组。从近端切口往离心方向，间隔 越远神经修复程度越低，可能是近端切口轴浆运输分泌神经生长因子的关系。使用人胚雪旺细胞修复大鼠周围神经缺损可以获得接近于大鼠自体神经移植的效果，说明人雪旺细胞可以引导大鼠神经细胞，并且分泌的生长因子对大鼠神经细胞具有一定作用。可以设想，在修复人体周围神经缺损时，人胚雪旺细胞人工神经可能发挥更好的修复效果。回忆整个实验，通过活体肢体功能观察、靶器官肌肉测量、电生理检测、辣根过氧化物酶示踪、

20、连续组织切片以及图像分析相结合的方法，可以较全面地评价周围神经再生的状况；用PLGA中空管和plyglatin910纤维负载人胚雪旺细胞构建的人工神经可以修复大鼠20的周围神经缺损，并且具有生物相容性佳，可塑性强，管壁浸透性和降解时间可调控等优点，使人胚雪旺细胞人工神经修复人周围神经缺损成为可能。构建的组织工程化人工神经修复大鼠坐骨神经缺损，可获得接近于自体神经修复的效果。这些特点为将来应用人胚雪旺细胞源组织工程神经修复周围神经缺损奠定了坚实的根底，使其具有更加广阔的开展前景。【参考文献】1FansaH,KEIlhff.parisnfdifferentbigeniatriesseededith

21、ulturedShannellsfrbridgingperipheralnervedefetsJ.NeurlRes,2022,26(2):167.2SiuisN,ShaHerHE,ShulteEversu,etal.Nerveregeneratinarssa2ragapintheratediannerveusingaresrbablenervenduitfilledithShannellsJ.JNeursurg,2022,103(6):1067.3EvansGR,BrandtK,KatzS.Biativeply(L-latiaid)nduitsseededithShannellsfrperipheralnerveregeneratinJ.Biaterials,2002,23:841.4sahebiA,FullerP,iberg.EffetfallgeneiShannelltrans-plantatinnperipheralnerveregeneratin.ExpNeurl,2002,173:213.5程飚，陈峥嵘组织工程化人工神经构建的方法研究J中国矫形外科杂志，2002，9(5)：456-4596王晓冬，顾晓松，张