雪灵芝提取物对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响

1、雪灵芝提取物对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响【摘要】目的讨论雪灵芝提取物对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响。方法以人肝L-02细胞作为研究对象，用四环素建立肝细胞脂肪变性模型。将实验分为诱导组，继续诱导组、脱离诱导组，用油红染色观察细胞形态和细胞内脂滴的形成情况，并测定细胞内甘油三酯(TG)含量的变化。结果雪灵芝提取物(2060gl-1)可明显降低细胞内TG值，并呈剂量依赖性。结论雪灵芝提取物通过减少细胞内TG的生成从而阻止肝细胞脂肪变性。【关键词】雪灵芝;四环素;甘油三酯Abstrat：bjetiveTstudytheeffetsfArenariakansuensisextrats(AKS)nhe

2、patytesteatsisinduedbytetraylineinvitr.ethdsSteatsisdelfhepatytesestablishedbyaddingtetraylinetthegringL-02ellstrain.Lipiddrpletsinthehepatyteserebservedbyilredstainingandthententftriglyeride(TG)inhepatytesaseasuredithanalyzedkit.ResultsAKS(2060gl-1)nentratindependentlydereasedthelevelfTGinhepatytes

3、.nlusinAKSanpreventhepatytefattydegeneratinviainhibitingTGprdutin.Keyrds：Arenariakansuensis(AKS);Tetrayline;TG非酒精性脂肪肝(nn-alhlifattyliverdisease,NAFLD)是一种无过量饮酒史(每周饮酒折合酒精量小于40g)、以肝本质细胞脂肪变性和脂肪储积为特征的临床病理综合征1。随着人民物质生活程度的进步，生活方式和饮食构造发生了显著的改变，再加上科学技术的飞跃开展，发现和被检测到的NAFLD患者逐年升高。由于NAFLD是肝硬化、肝癌的重要病因2，3，所以对其进展深化

4、地研究具有非常重要的意义。雪灵芝(Arenariakansuensis，AKS)系石竹科蚤缀属多年生草本植物，藏药名为阿仲嘎保，分布于西藏、青海、四川、甘肃，是一种极为珍贵的藏药资源，有悠久的药用历史4。以全草入药，性味甘寒，有清热解毒、利胆退黄、通淋止痛的作用，主治流感、黄疸、肺炎、筋骨疼痛、淋病等，还具有抗缺氧成效5和对酒精性肝损伤有保护作用6。本实验研究了雪灵芝提取物对四环素诱导的脂变细胞的影响，为进一步开发雪灵芝保健产品提供理论根据。1材料与仪器1.1仪器2培养箱(美国FrasientifiIn公司)，倒置显微镜(日本lypus公司)，酶联免疫检测仪del-450(美国Bi-Rad公司

5、)，旋转蒸发器(RE-52型，上海亚荣仪器厂消费)。1.2试剂雪灵芝，由西藏阿仲嘎保生物制品提供;1640培养液购自赛默飞世尔生物化学制品(北京);血清购自海克隆生物化学制品(北京);四环素(实验室用)购自生工生物工程(上海);油红购自美国Sina公司;四甲基偶氮唑盐(TT)试剂盒购自美国Aers公司;甘油三酯(TG)测定试剂盒购自浙江东欧生物工程。2方法2.1肝细胞培养人正常肝细胞株L-02，购自中国科学院上海生命科学研究所，用含10%胎牛血清1640培养基传代培养。2.2雪灵芝提取物的制备将KAS全草粉碎，以6倍量的95%乙醇加热回流提取3次，1h/次，合并提取液，浓缩枯燥得AKS乙醇提取

6、物。残渣挥干乙醇，用6倍量的蒸馏水加热回流提取3次，1h/次，合并提取液，浓缩枯燥得AKS水提取物。2.3四环素浓度确实定将处于对数生长期的L-02细胞调整浓度为5104个/l培养于96孔板中，分别参加不同浓度的四环素(见表1)，用TT7比色法测定细胞增殖情况(以吸收度D值表示)。结合细胞形态观察，选择对细胞活性影响小，不会导致细胞裂解死亡的浓度作为诱导细胞形成脂肪变性的最正确浓度。2.4雪灵芝提取物浓度确实定将处于对数生长期的L-02细胞调整浓度为5104个/l培养于96孔板中，分别参加不同浓度的雪灵芝提取物(见表2)，用TT比色法测定细胞增殖情况(以吸收度D值表示)。结合细胞形态观察，将对

7、细胞活性影响小，不会导致细胞裂解死亡的浓度定为最高给药浓度。2.5肝细胞脂变模型的建立将处于对数生长期的L-02细胞分为两组，即：对照组、诱导组，使每组细胞浓度均为5104个/l。对照组：用正常培养基培养;诱导组：每毫升正常培养基中加四环素12g培养。在各实验条件下培养48h，搜集细胞冻融液，严格按照TG试剂盒规定操作，测定其中TG的含量。制备油红染色8标本，观察细胞脂滴数的变化。2.6雪灵芝提取物对肝细胞脂变模型的影响将处于对数生长期的L-02细胞分为3组，使每组细胞浓度均为5104个/l。诱导组：损伤同时加药治疗48h;继续诱导组：先损伤48h，再在损伤的同时加药治疗48h;脱离诱导组：先

8、损伤48h，再加药治疗48h。每组内均设有空白对照、模型、阳性对照及高、中、低3个剂量组，在各实验条件下搜集细胞冻融液，严格按照TG试剂盒规定操作，测定其中TG的含量。用100gl-1烟酸作为阳性对照药。2.7数据处理所有数据均以s表示，采用方差分析进展统计处理。3结果3.1四环素作用浓度确实定观察细胞形态发现，正常肝细胞为多边形，胞膜完好界限清楚，细胞浆丰富。四环素15gl-1组细胞数量与正常细胞相比根本不变，低倍镜下可见局部细胞形态有少许变化，但漂浮坏死细胞较少。30gl-1组细胞增大变圆，数量有减少。120gl-1组细胞多呈圆形或椭圆形，数量大大减少，细胞膜不完好，有破损(图13)。TT

9、实验检测结果提示：四环素浓度超过30gl-1时吸收度(D值)下降明显，对细胞增殖影响力较大(表1)，再根据相关文献9报道，选择12gl-1作为四环素造模剂量。表1TT法检测四环素对肝细胞生长活性的影响(3.2雪灵芝提取物的浓度确定TT检测结果提示(表2)，当AKS醇提物浓度超过80gl-1时，吸光度(D值)下降明显，对细胞增殖影响较大，AKS水提物出现了浓度越高，细胞增殖才能及活性越强的特点。再结合预试结果，将雪灵芝提取物的实验浓度定为20，40，60gl-1。表2TT法检测雪灵芝提取物对肝细胞生长活性的影响3.3油红染色光学显微镜观察正常L-02细胞，细胞内仅可见点状散在红色脂肪滴(图4)，

10、经12gl-1四环素离体诱导48h后，细胞内出现大量聚集成颗粒状的红色脂肪滴(图5)。而正常L-02细胞经60gl-1雪灵芝提取物与12gl-1四环素共同培养48h后，细胞内脂滴与模型细胞相比有所减少见图67。转贴于论文联盟.ll.图4正常细胞(100)图5模型细胞(100)图6AKS水提物(100)图7AKS醇提物(100)3.4肝细胞内TG含量的测定实验结果说明(见表2)，各组加四环素的模型细胞比不加任何药物的正常对照细胞胞浆内的TG值明显升高，参加烟酸的阳性对照细胞与模型细胞相比细胞内TG含量明显降低。各组给予雪灵芝提取物处理后，细胞内TG值均出现了明显的降低。继续诱导组细胞内TG值与模

11、型细胞相比，差异明显(P0.05)，脱离诱导组细胞内TG值降低最为明显，说明只要停顿向培养液中加造模药，细胞内累积的甘油三酯可以自行降低，这与治疗脂肪肝首要在于去除病因的理论是一致的。AKS醇提物在3组实验中均表现出较好的降脂作用(高剂量与模型组比拟，P0.01)，且各剂量之间存在着一定的量效关系。AKS水提物在3组实验中，中剂量(40gl-1)的降脂作用强于高、低剂量组(P0.01)。表3AKS对脂变细胞TG含量的影响4讨论本实验采用四环素制备肝细胞脂变模型，四环素属于抗生素类化学药物，该药脂溶性较好，具有肝毒性，能很好地浸透到大多数组织和体液中，且较易进入细胞内10。四环素引起脂肪肝的机制

12、是抑制体内蛋白质的合成，特别是肝的载脂蛋白的合成，使肝内VLDL分泌发生障碍，从而不能使肝内TG运出肝细胞外，脂质以脂滴的形式聚于细胞内置网和高尔基复合体内。脂质及TG含量增加，肝脏脂质过氧化反响也增强，肝组织学检查显示，肝细胞产生明显的小泡性脂肪变性，符合非酒精性脂肪肝病理学研究结果11。其抑制蛋白质作用机制可能通过抑制肝细胞线粒体DNA复制或干扰DNA转录，使RNA合成减少，从而使RNA翻译成载脂蛋白的量减少。通过抑制肝内TG的转运及肝细胞线粒体对脂肪酸的-氧化，从而诱发肝细胞脂肪变性。本实验将雪灵芝提取物作用于离体细胞模型，共分为3组：诱导组，损伤同时加药治疗2d;继续诱导组，先损伤2d

13、再在损伤同时加药治疗2d;脱离诱导组，先损伤2d再加药治疗2d。诱导组可以考察药物对脂肪肝的预防与减轻作用，继续诱导组和脱离诱导组可以考察有化学损伤因素存在或曾经服用肝毒性药物造成肝损害后，药物对肝细胞的治疗与保护作用。由脱离诱导组实验结果可知，一些高脂血症的患者不用马上服用降脂药，首先应该停顿使用或接触具有肝毒性的化学物质，通过中药保健品或单纯饮食疗法即可获得痊愈。目前对NAFLD的治疗临床上多采用西药治疗，主要分为：HG-A复原酶抑制剂、胆汁酸螯合剂、苯氧芳酸类、烟酸类等。西药对于高脂血症患者具有起效快、作用强的特点，但这些药物对人体均有不同程度的毒副作用，长期服用经常会出现不良反响，而采

14、用传统中药治疗脂肪肝，能有效防止并发症，减少由药物引起的不良反响，研究和开发降脂中药有良好的前景和重要的意义。雪灵芝中已经说明构造的19种化合物大局部是脂溶性较高的12。其中三萜皂苷、环肽、生物碱(-咔波啉)、阿魏酸被认为是雪灵芝中重要的活性成分。近年来，三萜皂苷、环肽类化合物在抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗菌等方面的作用，已引起了广泛的关注13。本实验对雪灵芝醇提和水提物进展了研究，认为雪灵芝醇提物具有明显的降低脂变肝细胞内甘油三酯的作用，进一步研究雪灵芝中的有效成分，可以开发出新的有价值的降脂药物。【参考文献】1范建高.酒精性和非酒精性脂肪肝性肝病J.中华肝脏病杂志，2022，11(11)：

15、692.2FarrellG,LarterZ.Nn-alhlifattyliverdisease:frsteatsistirrhsisJ.Hepatlgy,2022,43(2):S99.3HaiS,KubS,ShutT,etal.Hepatellulararinaarisingfrnn-alhlisteathepatitis:reprtftasesJ.SurgTday,2022,36(4):390.4李明，伍贤学，成丽.藏药雪灵芝研究进展J.中草药，2022，38(11)：附1.5张丽，黎霞，黄叶梅.雪灵芝对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用J.四川师范大学学报(自然科学版)，2022，30(3)：395.6赵鹏，李彬，姚思宇，等.雪灵芝对酒精性肝损伤保护作用的实验研究J.中华中西医杂志，2022，17(4)：1901.7马金霞.TT比色法用于肿瘤细胞体外药物敏感性试验的检测J.临床检验杂志，2002，20(2)：104.8杜卓民.实用组织学技术.第2版.北京：人民卫生出版社，1998：318.9苏宝亮，陈真，徐厚明，等.肝细胞脂肪变性模型形态的研究J.中国医科大学学报，2022，35(4)：