3730测序原理及基本峰图分析

1、3730测序原理及结果分析 测序反应原理双脱氧链末端终止法Sanger法【1977； Fred Sanger 】） 在包括DNA聚合酶、DNA模板、单链寡核苷酸引物、4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）及 4种ddNTP（ddATP、ddGTP、ddTTP和ddCTP）的测序反应体系中，DNA聚合酶在模板链指导下，不断地逐个将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延伸，合成出新的与模板互补的DNA链。在链的延长过程中一旦加入双 脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于其双脱氧核糖的3位置缺少一个羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，链终止延伸。 形成一系列具有相同5-引物端和以

2、ddNTP残基为3端结尾的长短不一的片段的混合物，通过毛细管电泳并经过分析从而获得模板DNA的核苷酸序列。“双脱氧末端终止”的含义 PCR反应 测序反应 DNA 聚合酶 Taq酶 测序酶 引物 一对 单向 底物 dNTP dNTP+ddNTP* 模板 量少，质量要求低 质量要求高 产物 等长的DNA片段 相差一个碱基的一系列片段 荧光标记 无 bigdye V3.1 测序产物 指数扩增 线性扩增测序反应与PCR反应的比较正 常 峰 图1问 题 峰 图2基本峰图分析正 常 测 序 结 果长片段PCR峰图信号图短片段PCR峰图 -信号图PCR终止PCR终止峰终止峰后的噪音峰PCR终止峰噪音峰 一、

3、插入或缺失特征：从模板的插入或缺失位置开始出现双峰。插入位点二、结 构1.Poly 结构PolyA/T一般会导致后续出现重叠峰Poly在序列的前端对信号影响较小PolyG/C很容易导致信号中断和信号衰减2.高 G C局部高GC一般会导致信号中断或乱峰Poly-G也是高GC的一种高GC含量导致信号衰减三、峰图移码1、引物问题： （1）新引物：合成时部分引物多了一个碱基或者少了一个碱基 （2）引物降解2、结构导致移码（POLY结构，重复序列）3、插入突变或缺失突变导致移码（部分突变）缺失突变导致移码引物问题引起的移码一般从峰图起始端就开始出现，结构引发的移码是在结构之后才开始出现。四、模板不纯1、

4、PCR有两套模板(非特异性条带)2、盐离子等杂质干扰或两套模板大小相近会产生自始至终的双峰。五、杂合六、特殊问题1、干扰峰（染料峰）2、引物二聚体峰3、宽峰，飘峰4 、钉子峰5、模板量高染料峰和酒精峰染料峰 固定出现在70bp和110bp处无信号峰型无引物结合位点或没加模板引物二聚体解决方案：重跑或重测可以解决但要注意是否是毛细管寿命问题宽峰，飘峰钉子峰产生的原因：毛细管内有气泡，灰尘，和尿素结晶等。反射激光信号很高，且是全波长的，所以四色荧光并存。模板量高测序产物降解峰特征：在220、450bp附近G碱基降解，峰型扩散。（1）Chromas（2）Sequence Scanner v1.0（3） Sequencing Analysis 5.2峰图查看及处理常用软件Chromas优点：简单方便，可用于直观的查看峰图序列。有查找以及互补反转功能。缺点：不能查看原始信号Sequence Scanner v1.0优点1：操作简单，可以整版查看峰图质量，可显示原始信号Sequence Scanner v1.0Sequence Scanner v1.0优点2：软件对峰图质量有初步判断（trace score），并用颜色区分等级。两张都是得分39分功能大致与sequence scanner相同，多了重