医学免疫学-第二十二章-免疫学检测技术的基本原理

1、湖北理工学院医学院病原生物学与免疫学教研室1湖北理工学院精品课程医学免疫学2第二十二章 免疫学检测技术的基本原理第一节 抗原或抗体的体外检测第二节 免疫细胞的检测第三节 免疫细胞功能测定3第一节 抗原或抗体的体外检测原理：抗原抗体在体外特异性结合后，出现肉眼可见或借助仪器可检测的各种现象，据此对样品中的抗原或抗体能进行定性、定量、定位的检测。血清学反应 ：进行抗原抗体反应时，以往多采用人或动物的血清作为抗体来源，故体外的抗原抗体反应也称血清学反应。一、抗原-抗体反应的特点1、抗原-抗体反应的特异性 一种抗原通常只能与其刺激机体产生的抗体结合，这种抗原-抗体结合反应的专一性称为特异性。42、抗原

2、-抗体反应的可逆性 非共价键结合的抗原-抗体复合物不稳定，降低溶液的pH值或提高溶液的离子强度，可使抗原-抗体复合物离解（即具可逆性）。3、抗原-抗体反应的可见性 抗原与抗体结合后能否出现肉眼可见的反应取决于二者的比例和浓度。4、抗原-抗体反应的阶段性 分为两个阶段，第一个是抗原-抗体特异性结合阶段，其特点是反应快，一般不能为肉眼可见；第二阶段为反应可见阶段，根据参加反应的抗原物理状态的不同，可出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象，其特点是所需时间长，且受电解质、温度和酸碱度等因素的影响。5二、抗原-抗体反应的影响因素1.电解质 抗原和抗体在中性和弱碱性条件下，表面带有较多的负电荷，适当浓度的电解质

3、会使他们失去一部分负电荷而相互结合，出现肉眼可见的凝聚团块或沉淀物。抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液，以供给适应浓度的电解质。2.温度 较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会，从而加速反应的出现。常用37水浴保温。3.酸碱度 血清学反应常用pH为6-8，过高或过低的pH可使抗原抗体复合物重新离解。6三、抗原-抗体反应类型和检测方法（一）凝集反应：颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下（电解质、pH、温度等）出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。 根据抗原的性质分为直接凝集试验和间接凝集试验。 1.直接凝集试验颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的称作直

4、接凝集试验。按操作方法可分玻片法和试管法两种。（1）玻片法 为一种定性试验。将含有已知抗体的诊断血清与待检抗原悬液在玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。 此法简便快速，适用于新分细菌的鉴定或分型。如沙门氏菌的鉴定。也可用已知的诊断抗原，检测待检血清中的相应抗体，如ABO血型鉴定。7伤寒杆菌免疫血清 伤寒杆菌免疫血清 生理盐水（NS）+ + +大肠埃希菌 伤寒沙门菌 伤寒沙门菌阳性：液体变清，并有乳白色凝集块出现。阴性：液体仍然混浊，无凝集块出现。菌种鉴定 8不凝集（-） 凝集（+） 血型鉴定AB 诊断血清 血型鉴定试验结果与判定血型 抗A 抗B A + - B - +

5、AB + + O - - 910（2）试管法 为一种定量试验，用以检测血清抗体含量。以协助疾病的诊断，如肥大反应、外斐反应等 。 将待检血清用生理盐水作倍比稀释，然后加入等量抗原，置37水浴数小时观察。视不同凝集程度记录为+(100凝集)、+(75凝集)、+(50凝集)、+(25凝集)和-(不凝集)。以其+以上的血清最大稀释度为该血清的凝集价(或称滴度)。 试验时必须设置阳性血清、阴性血清和生理盐水等对照。112.间接凝集试验(indirect agglutination)将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒状载体表面，与相应抗体作用，在电解质存在条件下，出现的特异性的凝集反应称为间接凝集反

6、应。用来检测待检血清中细菌、病毒、螺旋体、寄生虫抗体及自身抗体（抗核抗体、类风湿因子等）。 优点 敏感性高，比直接凝集反应敏感2-8倍。 常用载体 用红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等颗粒作为载体，当载体吸附了可溶性抗原后即称为致敏颗粒。12间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test)：将已知Ab 先与被检的可溶性Ag混合，隔一定的时间后再加入致敏颗粒，如果已知抗体与被测抗原结合，不再出现凝集现象者称为间接凝集抑制试验。常用与妊娠诊断，即用乳胶间接凝集抑制实验检测早期妊娠妇女尿中的绒毛膜促性腺激素。左侧对照实验：出现均匀的凝集颗粒。妊娠诊断试验阴

7、性：出现凝集现象，即凝集未被抑制，说明待检尿液中无HCG。妊娠诊断试验阳性：不出现凝集，即凝集被抑制，说明待检尿液中有HCG。 凝集（试验阴性）不凝集（试验阳性）13反向间接凝集反应：是将已知抗体吸附到载体颗粒表面，以检测相应可溶性抗原的凝集反应。如检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及甲种胎儿蛋白（AFP）协助诊断乙型肝炎和原发性肝癌。3. 协同凝集试验(COAG) 葡萄球菌A蛋白(SPA) 能与多种动物IgG分子的Fc片结合，结合后保持其抗体活性，当与相应的抗原结合时，就可产生凝集反应。本法广泛应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。14（二）沉淀试验 可溶性抗原与相应的抗体结合，在一定条件下，

8、形成肉眼可见的白色沉淀物称为沉淀反应(precipitation)。 参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，抗原分子较小，如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等。1.环状沉淀试验 在内径为2-3mm的小试管底部先加入已知抗血清，然后沿试管壁缓缓加入已适当稀释的待测抗原于血清层上，使之成为分界清晰的两层。数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。用于法医的血迹鉴定、昆虫吸血性测定、炭疽病的诊断等。 152.琼脂扩散试验 琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，1琼脂凝胶的孔径约为85nm，各种抗原抗体在琼脂凝胶中自由

9、扩散。 用琼脂制成固体的凝胶，使抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，当二者在比例适当处相遇形成肉眼可见的沉淀物，即发生沉淀反应，形成肉眼可见的沉淀带，称为琼脂扩散。1617双向双扩散：即用1琼脂浇成厚2-3mm的凝胶板，在其上打圆孔，是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。 用8% Nacl溶液制1%琼脂糖平板，打孔（孔径6 mm周边与中心孔距3 mm）。183.对流免疫电泳(counter immunoelectroph

10、oresis) 原理 抗原在碱性溶液(pH82)中带负电荷，在电场中向正极移动，而抗体球蛋白带电荷弱，在琼脂电泳时，由于电渗作用，向相反的负极泳动。将抗体置正极端，抗原置负极端，电泳时抗原抗体相向泳动，在两孔之间形成沉淀带。 琼脂凝胶制备 选用优质琼脂（或琼脂糖），浓度为1-2，pH通常用pH8.2-8.6的巴比妥缓冲液，离子强度为0.025-0.075molL，并加0.01硫柳汞作防腐剂。19极-+极AbAgAbAbAgAg 试验操作 制备琼脂凝胶玻板、打孔，挑去孔内琼脂后，将抗原置负极一侧孔内，抗血清置正极侧孔。加样后电泳30-90min观察结果。20试验操作 制备琼脂凝胶玻板、打孔，挑去

11、孔内琼脂后，将抗原置负极一侧孔内，抗血清置正极侧孔。加样后电泳30-90min观察结果。本法优点 a.敏感 较双扩散敏感10-16倍；b.快速 仅需1h左右，大大缩短了沉淀带出现的时间。c.用途 适用快速诊断检测。如乙型肝炎抗原的快速检测，口蹄疫等的快速确诊。21（三）免疫标记技术：是利用荧光素、酶、放射性同位素等标记抗体或抗原进行抗原抗体反应。具有特异性强，敏感性高的特点，广泛用于多种抗原抗体的测定，有免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫测定法等实验方法。抗体、抗原分子小，在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。有一些物质即使在超微量时也能通过特殊的方法将其检查出来，如果将这些物质标记在抗体

12、分子上，可以通过检测标记分子来显示抗原抗体复合物的存在，此种根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术。 22（四）补体结合试验 补体结合试验是应用可溶性抗原，与相抗体结合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入致敏红细胞(溶血系)，可根据是否出现溶血反应判定反应系统中是否存在相应的抗原和抗体。参与补体结合反应的抗体称为补体结合抗体。补体结合抗体主要为IgG和IgM。通常是利用已知抗原检测未知抗体。 23（五）中和试验 根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验称为中和试验。中和试验极为特异和敏感，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离

13、株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清的质量评价和测定动物血清抗体的检测等。 中和试验的基本过程 先将抗血清与病毒混合，经适当时间作用。然后接种于宿主系统以检测混合液中的病毒感染力。宿主系统可以是鸡胚、动物或细胞培养等，目前大多采用细胞中和试验。24 根据其产生的保护效果的差异，可判断该病毒是否已被中和，并根据一定方法计算中和的程度(中和指数)，即代表中和抗体的效价。 种类 根据测定中方法的不同，中和试验主要有两种。一是测定能使动物或细胞死亡数目减少至50(半数保护率，PD50)血清稀释度，即终点法中和试验。二是测定使病毒在细胞上形成的空斑数目减少至50时血清稀释度，

14、即空斑减少法中和试验。 毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。 25第三节 细胞免疫测定法a、细胞免疫体外检测法E玫瑰花结实验：取受试者外周血，分离淋巴细胞，与绵羊红细胞在培养液中混合，在42h作用后，绵羊红细胞吸附于具有E受体的T细胞的周围，形成玫瑰花状的细胞集团。临床用于：1、细胞免疫缺陷病的诊断，原发性或继发性细胞免疫缺陷病时，E花结形成较低；2、观察肿瘤治疗及判断愈后；3、监测移植排斥反应，E花环形成百分率增高，提示排斥反应发生。2627淋巴细胞转化实验：应用最广的是PHA的T细胞非特异性转化实验。取全血或分离的淋巴细胞，加入定量的植物血凝素（PHA）培养液，36孵育72h，涂片、