琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度MIC资料全

1、琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)|琼脂稀释法琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50笆左右的定量MH琼脂中，制成含 不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的 琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结 果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.27.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加 剂；其它链球菌使用含5% (V/V)绵羊血的MH琼脂(当试验磺胺药时，使用溶解的马血)。含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同

2、浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在4550笆水 浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度34mm。通常按1：9比例配制药 物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置 28笆冰箱可贮存5天。接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1： 10稀释，以多点接种器吸取制备好菌 液(约12ul)接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为58mm的菌斑。 接种好后置35笆孵育1620h (甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满 24h)，观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧

3、环境中孵 育。结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。 在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌 生长的最低药物浓度作为终点浓度。如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平 板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。原理：将抗菌药物配制到琼脂培养基中成：128 u g/ml 、 64 u g/ml 、 32 u g/ml 0.06 ug/ml对倍稀释的浓度系列多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点 种到琼脂表面，经35C16-20小时培养

4、肉眼观察细菌生长，以未见细菌生长平板的 最低药物浓度为最低抑菌浓度(MlC)抗菌药物保存液的准备1估算抗菌药物最小称量琼脂稀释法最高药物浓度为128ug/ml药物和培养基的体积比1:14,即药物浓度将成15倍稀释，因此保存液为128ug/mlX15 = 1920ug/ml如果1次用量为10ml ,则：抗菌药物最小称量=1920ug/ml*10ml抗菌药物的效价抗菌药物保存液的准备2抗菌药物稀释选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释, 稀释液需要量见下列公式：怦沈、芸儿抗菌药物实际称量*效价稀释液体积保存液浓度(i920ug/ml)抗菌药物保存液的准备3实际操作：先计算完成一批试验需几次完成,每次

5、用 量多少，然后可一起称量,一起稀释,然后 按每次需要量分装在试管中，贴上标签，注 明药物名称，浓度,体积数及配制日期，置 与C-20C保存,备用。培养基需氧菌MH肉汤或琼脂苛氧菌嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base + 补充园子SR158链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血卡他莫拉菌属：MHA琼脂+5%脱纤维 羊血淋球菌：CC Agar Base+L53厌氧菌Wilkins chalgren anaerobe 琼月旨菌液准备1生长法：无菌环取4-5个苗落大小形态一致的菌落 顶部后接种于4-5mlMH肉汤内35P培养4-6小时到对数生长期，亦可过 夜培养，但不允

6、许超过18小时用肉汤/生理盐水枝正至0. 5麦氏管浓度1- 2X108CFU/ml菌液准备2直接菌落悬浮法：从孵育了 18-24h新鲜培养物的平板上，用 无菌环取单个菌落接种于无菌肉汤/生理盐水内 校正至0. 5麦氏管浓度1-2X10FU/inl 推荐用于苛氧菌和簪在的MRS菌液准备3对绝大多数细菌来说，上述用生长法或直 接菌落悬浮法制备的0.5麦氏浊度的菌悬 液,应该再用无菌肉汤或生理盐水行1: 10 稀释,此时菌液浓度l-2*107CFU/mL调 整好的菌液应该在制备后的15分钟内完成 点种菌液准备4如一次实验需完成50株或100株细菌，则细 菌要编上工作序号1-50或1-100,并在结果

7、 记录纸上要一一对应写上工作序号和菌种 编号琼脂稀释法药敏平板的制备1配制融化的MH琼脂或适合其他苛氧菌、厌 氧菌等特讯细菌的培养基，待冷却到48- 5OC,浇制药物平极.取灭菌的9 Omni平板12只，用记号笔在平板 底部作好“点种标记”、“药物名称”.“药物浓度”，浓度从0.06ug/(nl12811 g/ml,每种浓度1只平板共12个浓度系列。琼脂稀释法药敏平板的制备2取11支无菌玻璃试管(13X 100mm),每支试 管标记为：960, 480, 240, 120, 60, 30,15, 7. 5, 3. 75, 1.875, 0. 935 u g/m,并于上述每根管子中用 无菌移液管

8、加无菌稀释液L 5ml琼脂稀释法药敏平板的制备3将保存在-20C冰箱中的1920ug/ml浓度的抗 菌药物保存液取出融化后，用无菌移液管吸取2. 5ml加入到128 u g/ml标记的平板内1ml移液管内剩余的1. 5山1加入到960标记的试管内， 混匀后再吸取2. 51111加入到64 u g/ml标记的平板 内1ml移液管内剩余的1. 5m 1再加入到480 u g/ml标记 的玻璃试管内；混匀后再吸取2. 5ml依次类推，直至最后个。,06 u g/ml标记的平皿 内加入1虬则抗备药物稀释完成琼脂稀释法药敏平板的制备4准备2只无药的平板,作点种前和点种后质 控对照所有药物平板应保持表面干

9、燥，不可有肉 眼可见的水珠（可在35 C孵箱内倒置平板 开盖烘干15-20分钟）琼脂稀释法药敏平板的制备5如果需使用的药物平板为lOOXIOOnim的方平板， 则每根玻璃管内需加入2. 5ml的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4. 5m 1 每只方平板应加入2nd抗菌药物试液无菌吸管内应存留下2. 5ml与下一个浓度的玻璃 试管内的2. 5ml稀释液进行充分混匀药敏培养基应加入28皿1测试菌液的点种1预先将点种针和点种板高压灭菌，并在孵箱内烘干 (52孔、100孔、或21孔)将已调整好浊度(l-2X107CFU/ml)的菌液用微量 加样器将菌液依次加入菌液点种板小孔加 并作

10、好 与药期羊敲相应的点种标记,一般每小孔内应加入 菌液270 uL 每批试验均须保留有质控菌位置和 无菌菌液位置用酒精棉球清洁多点接种器后，将点种针安装在 多点接种器架子上，再将加好菌液的点种板安置 上多点接种器的点种板位置上测试菌液的点种2开启多点接种器进行点种，因每一才艮点种 针直径约因此点种到药物平板上每点 的菌液量约为2ul,所以接种量为IO, CFU/点种时应先点种对照前的质控平板，然后 从最低药物浓度开始点种依次点种到药物浓度最高的平板药物平板的孵育上述接种好的平板应在室温下静置至接种点上的 菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒置，于 35C孵育16-20小时如葡萄球菌苯喳西林和甲氧

11、西林，则需33-35C, 绝对不能超过35C,孵育24小时、阅读结果 万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24 小时后，阅读结果淋病奈瑟球菌需在5%CO2空气环境中孵育20-24小 时，阅读结果结果阅读和判断结果阅读时，平板应置于黑色不反光的表面上， 记录的MIC是完全抑制细菌生长的最低抗生素浓度, 单个菌落或接种物所致的轻微的不清晰现象可忽 略不计，如果在MIC判断终点附近持续存在或多个菌落，或 者低浓度不长，高浓度生长；或者有俗称的跳管 现象，就应该检查试验菌的纯度，有否污染菌生 长，并尽可能重复试验。按当年的CLSI/NCCLS标准判断结果。质控菌株质控菌株药敏其他金黄色制枸球菌ATCC29213+大豚埃希菌ATCC25922+大肠埃希菌ATCC35218+产R内酰胺醇肺炎克甫伯菌ATCC700603+产超广谱B内耽胺酶铜绿展单胞菌ATCC27853+质控甬株质控菌株药敏其他肺炎说球菌ATCG49619粪腐球菌ATCC29212+检测胸腺嗨臆流感嗜血杆南ATGC49766+氨卡四-林敏感株流感嗜血杆篇ATGC49247+产团习