基因工程第三章

1、基因工程第三章第1页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二3.1.1 分子杂交与印渍技术的原理 分子杂交：不同来源的单链核酸（DNA或RNA），只要它们具有大致相同的碱基序列，经过退火处理，就能重新形成杂种双螺旋，这一现象称为分子杂交（molecular hybridization）。 3.1分子杂交与印渍技术第2页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二0复性RNADNA第3页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 第4页，共67页

2、，2022年，5月20日，12点6分，星期二印渍技术： Blotting印渍技术的原理首先由Edwen Southern在1975年提出。第5页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二其基本操作过程是：将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳分离后，置NaOH液中浸泡，从而将凝胶中的DNA变性为单链；然后将一张硝酸纤维素膜铺在凝胶上，上面放上大量吸水纸巾，利用吸水纸巾的毛细作用，将单链DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，再将膜置80烘干并使单链DNA分子固定在膜上，再用于分子杂交分析。第6页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二分子杂交实验第7页，共67页，2022年，5月

3、20日，12点6分，星期二Southern Blotting第8页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二印迹技术的类别及应用1、DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。2、RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。3、蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 第9页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二三种印迹技术的比较第10页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二探针技术：将已知序列的核酸片段用放射

4、性同位素、生物素或荧光染料进行标记，然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。 第11页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二3.2 PCR技术 PCR：聚合酶链式反应 （ Polymerase Chain Reaction），是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-复性-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。第12页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二PCR基本原理：变性-复性-延伸1变性：通常采用加热变性，即将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到940C，使双螺旋DNA解开成为单链。2

5、复性：通过降低反应温度至500C- 650C ，使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3端粘合，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3-OH。3延伸：将反应温度提高到约720C，在耐热DNA聚合酶的催化下，根据模板DNA提供的碱基顺序，合成两条互补链，从而使模板DNA扩增一倍。第13页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二PCR技术特点1、高度的敏感性。2、高度的特异性。3、操作简便快速。4、样品适用广泛。5、有一定程度的单核苷酸错误掺入。第14页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二引物 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩

6、增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度；两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。第15页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二引物的设计：引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为1821个碱基，可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物。 第16页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二（1）引物长度：18-21bp （2）（G+C）%含量：引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个

7、引物中（G+C）%含量一般以40%60%为佳。（3）引物的结构：无明显的次级结构（4）引物之间：不应发生互补 (5）引物3端配对精确和严格第17页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二引物引物3555基因组引物第18页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二PCR的反应原理第19页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二PCR技术的基本过程TaqDNA聚合酶模板DNA dNTP 引物Buffer预变性模板DNA dNTP 引物Buffer循环仪94oC59455 72 第20页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二1、dNTP: PC

8、R常用的浓度为50200mol/L，不能低于1015mol/L。四种dNTP的浓度应相同。2、 缓冲液：10 mM Tris.HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2。3、模板DNA：纯度与含量。4、反应参数。PCR的影响因素第21页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二（1） 变性-考虑酶的失活问题。一般为反应开始时用95oC2- 5 min，在后续循环中设为94oC 30 s - 1 min;（2） 退火-退火温度取决于引物的碱基组成、长度及引物与模板的匹配程度，一般在Tm 20-25oC左右；时间一般为30 s - 2 min；（3） 延伸温

9、度一般为72oC；时间取决于待扩增片段的长度。在通常情况下，Taq酶的延伸速率约为2 kb/min，而pfu为1 kb/min 。（4） 在最后一个循环结束后，需再在72oC下延伸10 min，以产物完整。第22页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。 为了保证反应的特异性，还应用ng级的克隆DNA，g水平的单拷贝染色体DNA或102-105拷贝的待扩增片段作为起始材料。 模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及结合在DNA上的蛋白。第23页

10、，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二 模板的纯度、含量测定 260nm 1 OD 双链DNA 50g /ml 单链DNA 40g /ml OD 260nm/ OD280nm 1.8第24页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二ddH2O 37.60L10 Buffer 5LdNTP mixture(2.5mM) 4L引物上(20pmol/L) 1L引物下(20pmol/L) 1L MgCl2(25mM) 4L模板(102-105 拷贝) 0.5LDNA Polymerase 0.4L总体积 50L第25页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二

11、95变性处理3min 94 30S 56 30S 72 1min 30个循环 72延伸7min 第26页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二第27页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二PCR产物纯化 从凝胶上尽量小的切下目的片段,放在一个干净的EP管中，称取凝胶的重量，并加入3倍体积的Buffer S1 (即100mg胶加300L Buffer S1)；盛胶EP管于50水浴10min，每2-3min摇动一次，至胶彻底融化；溶液加入到吸附柱内，13000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；第28页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二 加入

12、0.5mL的Buffer W1洗涤DNA，13000rpm离心15sec；弃去收集管中的液体，再加入0.5mL的W1 Buffer，静置1min，13000rpm离心15sec；弃去收集管中的液体， 13000rpm离心1min；把吸附柱放在一个干净的EP管内，在柱子膜中央加入30L Buffer T1, 室温放置1min,13000rpm 离心1min。 凝胶回收后的目的基因，各取5L电泳检测，并测定浓度以确定连接体系（此步必做）。第29页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二第30页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二第31页，共67页，2022年，5月2

13、0日，12点6分，星期二第32页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二PCR的主要用途 （一）目的基因的克隆：PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有： 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因；第33页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的DNA片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。 第34页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二（二）基因的体外突变：采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺

14、失、点突变等改造。（三）DNA的微量分析：由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析检测。 第35页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二3.3 生物芯片生物芯片（biochip）的概念指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。第36页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二根据生物分子之间特异性相互作用的原理，如DN

15、A-DNA、DNA-RNA、抗原-抗体、受体-配体之间可发生的复性与特异性结合，设计一方为探针，并固定在微小的载体表面，通过分子之间的特性性反应，检测另外一方有无、多少或者结构改变等第37页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray）。未来十年最具发展潜力的技术。第38页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二生物芯片的主要特点：高通量、微型化和自动化常用的生物芯片的分类：基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室第39页，共67页，2022年，5

16、月20日，12点6分，星期二基因芯片（Genechip） 又称DNA芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。第40页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二2.蛋白质芯片(proteinchip) 利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。 第41页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二芯片实验室(labs-on-chip) 高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统。实现

17、生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。第42页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二3.4 基因文库的构建第43页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二基因文库基因组文库第44页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二第45页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二为什么要建立基因文库？直接从含目的基因的生物中提取不行吗？第46页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二基因文库限制性内切酶克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因文库第47页，共

18、67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二基因组DNA文库基因组DNA限制性内切酶基因重组转化细菌体外包装第48页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二cDNA文库的组建：基因重组反转录酶mRNAcDNA第49页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二如何从基因文库中找到所需要的基因根据目的基因的有关信息基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质第50页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二3.6 酵母双杂交系统 酵母双杂交技术是1989年由Fields等最先应的。与其他技术相比，它省去了耗时耗力的

19、蛋白表达纯化以及抗体制备步骤，并且可以用于高通量的筛选，因此以其简便、快捷与廉价的优点迅速发展成为一种常用的研究蛋白质相互作用的方法。根据对文献的统计，目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。第51页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二原理转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的DB虽然能和启动子结合

20、, 但是不能激活转录。 而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 第52页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。主要结构由含有DNA 结合域和DNA 转录激活域二类载体以及酵母报告株构成。 将DNA BD 与已知的诱饵蛋白质X 融合,构建出BD - X质粒载体;将AD 基因与cDNA 文库,基因片段或基因突变体(以Y表示) 融合,构建出AD- Y质粒载体。第53页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二第54页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星

21、期二酵母双杂交系统的实验基本过程第55页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二 3.7 DNA碱基序列测定 DNA碱基序列测定即DNA一级结构的测定，目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和Sanger建立的双脱氧末端终止法。 第56页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二双脱氧末端终止法的主要操作步骤有：1获得待测DNA片段的单链模板：一般采用基因工程的方法以获取一定数量的单链待测DNA模板。可将待测DNA片段与噬菌体M13DNA进行重组，然后将其导入大肠杆菌进行增殖，M13噬菌体一般以单链DNA形式透出细胞再感染新的细菌，故此可获得单链D

22、NA模板。 第57页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二2合成寡核苷酸引物：在待测DNA片段的3-端合成一段互补的寡核苷酸引物，其顺序可为待测DNA片段3-端的一段已知顺序，也可为一段M13噬菌体的顺序。可利用DNA合成仪自动合成。3模板-引物杂交：将待测单链DNA模板与寡核苷酸引物混合，并在适当温度条件下进行保温处理，使引物与DNA单链模板的3-端进行杂交。 第58页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二4互补链的延长和终止：将上述杂交混合液分为四份，每份混合液中均加入DNA聚合酶，四种dNTPS，一种带放射性同位素标记的脱氧核糖核酸（如-32P-dATP）。此外，还需分别加入一种双脱氧核糖核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP）。然后在适当温度条件下延伸互补链，就可得到四组分别以A、G、C、T，终止的长短不一的互补链的混合物。因在互补链合成时，如掺入的是双脱氧核糖核酸，由于缺乏3-和2-OH，故可导致互补链合成终止。 第59页，共67页，2022年，5月20日，12点6分，星期二5电泳分离：将四