大鼠单根近球肾小管钠泵活性测定的改良方法

1、大鼠单根近球肾小管钠泵活性测定的改进方法【关键词】近球小管;钠泵;活性测定;改进方法;大鼠肾小管基底膜上的钠泵，是肾脏实现其功能作用的关键酶，测定该酶的活性，对不同状况下肾脏的功能研究具有重要的意义。测定单根肾小管钠泵活性的方法，duet首先于1979年进展了较为详细的报道1简称duet法，该方法目前仍是测定肾小管钠泵活性的最准确最常用的方法，特别是测定不同节段肾小管的钠泵活性2。过去的二十多年，duet法得到了一些改进3,4，但是改进并不显著。duet法的技术要求高，准备与操作过程都比拟复杂耗时，与32p接触时间较长，而该物质放射性相对较强，国内大多数实验室都不便开展，造成此项研究工作在国内

2、的几近空白。改进duet法简称改进法，即在不影响测定结果的情况下，简化操作条件及步骤，降低物耗和时耗，使它适用于国内一般实验室，就显得非常必要和迫切。1材料1.1实验动物雄性istar大鼠，体重200g，购自南方医大学动物实验中心。2实验方法选取10只大鼠，平均分为2组，分别用于duet法和改进法测定小管的钠泵活性，改进法实验方法如下：2.1单根肾近球小管的别离实验大鼠用1%戊巴比妥钠40gkg-1，ip麻醉后，右侧位固定于鼠板上。再沿脊柱左侧剪开皮肤，暴露肾脏，别离腹主动脉，结扎除左肾动脉以外的分支，经腹主动脉插管灌注左肾，先用1l1%肝素钠溶液，接着用1l04含0.2%胶原酶的别离液灌注。

3、灌注后迅速切下左肾，除去肾包膜和肾蒂构造，置于干净玻片上玻片下放置低温冰袋。用剃须刀片，将肾皮质沿皮质髓质轴切成0.51.0厚的薄片。将大约10片肾组织放入一容积为2l的离心管中，管内预先装有1l含0.15%胶原酶的别离液并预热至37，恒温水浴槽中孵育1520in，持续充入95%的2和5%2的混合气体。孵育完毕用2l含0.05%牛血清白蛋白的别离液漂洗34次，04保存并于30in内完成别离。汲取0.1l含肾小管组织的别离液到细菌学载玻片的中央凹处，在体视镜载物台上放置一个直径为90培养皿，内装干净冰水和碎冰块，在培养皿内放置一个适宜铝架，载玻片平放在铝架上，使玻片底部刚好与冰水接触提供04的别

4、离环境，用微别离针别离小管。识别近球小管是根据它与肾小球、肾小囊、入球小动脉和其它肾小管节段的解剖关系和形态学特点决定的。转移前的小管直接摄像并保存图片，根据放大倍率确定小管长度。3结果3.1微别离小管的结果图片见图1，a表示转移后的单根肾近球小管节段；b表示微别离的近球小管电镜图象。电镜下可见近球小管管腔面排列有长而密集的微绒毛箭头所示，它是近球小管独特的超微构造。其次可见侧突兴隆，质膜内褶较深，可达细胞的游离面，胞吞小泡多，溶酶体兴隆，长杆线粒体非常丰富，与质膜内褶平行排列。3.2两种方法钠泵活性测定结果与部分操作耗时比拟结果见表1，运用改进法测定钠泵活性结果无显著差异，但对小管长度确定平

5、均耗时和转移含32p的孵育液平均耗时明显降低。表1两种方法测定结果与部分操作耗时比拟注：*与duet法比p0.054讨论测定肾小管钠泵的活性，duet法仍是目前最常用的方法。本实验技术是在duet法的根底上，进展了较大的改进和完善，使实验条件和实验本身变得相对简单易行，可操作性大为进步，而且对测定结果并无明显影响。本实验方法的改进主要表达在以下十个方面：固定方法：与以往仰位固定比拟，右侧卧位固定，沿脊柱左侧手术，左肾动脉及腹主动脉暴露充分，手术过程快，对其它脏器的影响校灌注：选择从腹主动脉途径插管灌注，比直接在左肾动脉插管要平安快捷；先使用抗凝剂肝素冲洗，可以去除肾脏内血液成分，减少胶原酶的用

6、量以及方便后面的漂洗和别离。灌注液和灌注速度：使用高浓度低用量的灌注液，降低灌注速度0.5lin-1，可以进步胶原酶的利用率，缩短孵育时间，进步孵育效果。通气装置：本实验用一简易装置完成，即在医用氧气袋的橡皮管上连接一个三通管，在其中一个通道上接上一根聚乙烯小管，即可方便控制通气。微别离针：别离针是利用玻璃毛细吸管，在酒精喷灯上拉制而成，因为这种方法制备的微分针前端带有小弯钩，比用玻璃微电极拉制器拉制的微分针更加方便实用。别离环境：环境温度稍高，载玻片上小管周围液体稳态环境极易改变，严重影响小管生物活性，但是，在一般实验室，提供一个04的工作环境是比拟困难或造价高昂。本实验设计了一个简易的低温

7、操作环境，效果好，几乎无需本钱。小管长度确实定：将小管转移到另一载玻片上，使用倒置显微镜拍照，确定小管长度，然后再将小管转移到发生酶促反响的铝片上。这样操作难度大，小管暴露时间长，酶的活性容易受到影响。假如在体视镜上装上显像系统，就可以在小管别离后，转移前进展直接拍照。这样，既简化了操作步骤，又能最大程度保证小管及酶的活性。冻融材料：以往使用的干冰，在很多地方不易购置，保存时间又短。用存放在-80的超低温冰袋代替干冰，本钱极低，操作方便。酶促反响载体：将以往的带凹固定铝槽，换成超薄锡薄纸片，紧贴在金属盘内，反响终止后，直接将锡薄纸片转移到活性碳悬液中，快速方便，防止以往反复清洗铝槽造成的无机磷丧失，进步实验结果的准确性。由于32p的放射性较强，反响载体的改变可以大幅缩短操作者与辐射物接触的时间。密封金属盘：在小管钠泵活性测定的各个环节中，保证小管环境的相对密闭性，防止反响液蒸发或与水雾混