以潮霉素B抗性基因为选择标记的水稻立枯丝核菌遗传转化体系的构建

1、以潮霉素 B 抗性基因为选择标记的水稻立枯丝核菌遗传转化体系的构建由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻纹枯病是世 界性水稻三大病害之一。立枯丝核菌的致病机理相当复杂，其致 病能力是毒素，细胞壁降解酶和菌丝的机械压力这些因子共同作 用的结果2，5。至于以哪种因子为主，以及各因子间如何相互 协调作用还有待于进一步研究。本文构建了针对水稻立枯丝核菌 的原生质体遗传转化体系，为从分子水平上研究该菌，进而揭示 其致病机理奠定了坚实的基础。材料与方法1.1 菌株与培养基水稻立枯丝核菌菌株 Rh9 由扬州大学分离保存。大肠杆菌 E.coli DH10B用于载体分子的扩增和转化子中潮

2、霉素B抗性基因 的克隆。液体 PDA 培养基用于水稻立枯丝核菌菌丝的培养。固 体 PDA 培养基用于水稻立枯丝核菌原生质体的再生和转化子的 继代培养。液体 TB3 培养基用于原生质体的复苏。选择培养基 (含30yg/ml潮霉素和0.015%(W/V)琼脂的液体TB3培养基) 用于转化子的筛选。质粒 DNA用于转化的质粒载体pSM565(GenBank登录号为AY*) 由福建农林大学功能基因组学实验室保存。它带有潮霉素B磷酸 转移酶基因(Hyg)和氨苄青霉素抗性基因(Amp)。主要试剂裂解酶(来自Trichoderma harzianum)购自Sigma公司 。 * 购自 Seebio Biot

3、echnology公司。山梨糖醇(Sorbitol)购自 Bio Lab公司。限制性内切酶购自New England Biolab (NEB)公司。水稻立枯丝核菌原生质体的分离裂解液：10% (W/V)裂解酶；0.8 mol/L NaCl(pH5.8)。SuTC 溶液：20% (W/V)蔗糖，50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0), 50mmol/L 无水CaCl2,抽滤灭菌。挑取已生长 4-6 天的水稻立枯丝核菌 Rh9 菌丝块，捣碎后 放入100ml液体PDA (包含50|ag/ml amp)中，28C。下振荡培 养2-3天。将培养好的菌丝用孔径为60ym的尼龙膜过滤后，再 用

4、0.8mol/L Nacl (pH5.8)冲洗1-2遍。将菌丝刮出，用镊子撕 碎，放入约25ml裂解液中，28C，80r/min，裂解8h。悬浮有原 生质体的裂解液用灭过菌的尼龙膜过滤，再用 0.8mol/L Nacl 冲 洗尼龙膜两次。将滤液于4C，4500r/min,离心6min以收集原 生质体，用1ml SuTC重悬原生质体，保存于-80C。水稻立枯丝核菌原生质体的转化40%*溶液：含 40%( W/V) *的 SuTC 溶液。用SuTC将原生质体稀释至1x106个/ml。取2001与 gg pSM565载体(图1) DNA混匀，室温下静置20min。加入1.25ml 40%PEG 33

5、50混匀，室温下静置20min。加入5ml TB3液体培养 基混匀，室温， 80r/min 振荡复苏过夜。离心收集原生质体，加 入200川SuTC，轻轻吸打至沉淀完全溶解。将溶液加入冷却至 45-55C。的固体 TB3 (含 30|jg/ml hygromycin， 50|jg/ml Amp) 中，混匀后，倒入培养皿中。28C黑暗倒置培养5-6天。1.6 转化子的 PCR 鉴定和测序验证提取转化子的基因组 DNA 作为模板。根据 pSM565 中潮霉 素抗性基因的 5和 3端序列设计一对特异引物，上游引物 5- *GATG-3，下游引物 5-*AGAG-3，以 PCR 法 对转化子进行验证。反

6、应条件为：95C 3分钟；95C 30秒, 53C 30 秒， 72C 40 秒， 30 个循环， 72C 7 分钟。 PCR 验证后，切 胶回收目的条带，克隆后直接进行测序验证。结果与分析2.1 水稻立枯丝核菌原生质体的分离由表1可见：只有用0.8M NaCI (pH5.8)做为渗透压稳定剂 时，才可释放出水稻立枯丝核菌的原生质体。在 28C 下，发现裂 解 8 小时时，原生质体的得率最大。并且裂解酶质量浓度为 15 mg/ml 和 20 mg/ml 时的原生质体得率与 10 mg/ml 时相差不大 (图 2)，因此采用质量浓度为 10 mg/ml 的裂解酶来制备水稻立 枯丝核菌的原生质体。

7、分离得到的原生质体呈透明的近椭圆形， 中间可见1个或2个细胞核（图3）,它们可在-80C。下保存6个 月不丧失活性。PEG 介导的水稻立枯丝核菌原生质体遗传转化 使用本体系进行水稻立枯丝核菌转化时，转化频率为 5-6 个转化子/yg DNA。转化过程中发现水稻立枯丝核菌对潮霉素B很 敏感，只需使用含30yg/ml潮霉素B的培养基即可胜任转化子 的筛选任务。转化子的 PCR 和测序验证随机挑选 8 个转化子，提取其基因组 DNA 用于 PCR 验证。 发现除野生型和 2 个转化子未能扩增出条带外，其余均可扩增出 一条和载体一致的，大小为 750bp 预期的潮霉素抗性基因片段 （图 4）。将 5、

8、6、7、8 泳道的条带回收、克隆并测序，测得的 序列与潮霉素抗性基因序列完全匹配，表明潮霉素抗性基因已成 功转入水稻立枯丝核菌的基因组中。讨论本试验在制备水稻立枯丝核菌原生质体的过程中发现由于 在液体培养基中水稻立枯丝核菌的菌丝会聚集成球状生长，裂解 前需先将它们撕碎，否则原生质体的得率不高。并且在离心收集 原生质体时最好使用锥底管，否则原生质体容易悬浮在溶液中， 影响收集。总之，不同真菌原生质体的制备受到多种因素的影响， 需进行一系列相关实验以确定最佳分离条件。在建立水稻立枯丝核菌原生质体遗传转化体系的过程中发现该菌对潮霉素B极为敏感，相对于深黄被抱霉菌(Mortierella isabellina )、稻瘟菌(Magnap or the g risea)、赤霉菌(Gibbe rella fujlkurol)原生质体遗传转化体系中使用的潮霉素B的抗性筛选 剂量，400|jg/ml, 1