花生黑腐病菌分子检测技术与杀菌剂筛选

1、花生黑腐病菌分子检测技术与杀菌剂筛选 指导老师：潘汝谦:2022/9/181项目的意义花生是世界上最重要的油料作物之一我国花生种植面积居世界第二位，总产量居世界第一位花生黑腐病（Cylindrocladium black rot of peanut）是为害花生的最严重的毁灭性病害之一我国将花生黑腐病Cylindrocladium parasiticum列为国家进境植物检疫性植物病害我国对花生黑腐病的检测技术和防治方法还没有深入的研究，很多问题尚需解决为中国华南地区花生黑腐病防治等提供理论与实践基础遏制花生黑腐病的蔓延，保护我国花生和大豆产业2022/9/182现状分析花生黑腐病（Cylindr

2、ocladium black rot of peanut）是为害花生的最严重的毁灭性病害之一，迄今没有满意的防治手段。1965 美国1968 日本2009 中国设计检测花生黑腐病菌的特异引物，建立常规PCR技术，快速准确地检测潜在花生黑腐病菌的分子检测方法。筛选出对花生黑腐病菌有较好抑制作用的杀菌剂，并试验性进行温室药效试验。建立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线都有较好的理论和现实意义。2022/9/183表1 花生黑腐病菌世界分布范围注：花生黑腐病菌主要分布于美国、日本、韩国、印度尼西亚、斯里兰卡、巴西、澳大利亚、喀麦隆和洪都拉斯等20多个国家和地区。该表仅显示文献明确记载的地区。2022/9

3、/184图1 花生黑腐病菌主要分布国家2022/9/185项目简介本项目以我国新发现的花生黑腐病为研究对象，融合植物病理学、分子生物学和杀菌剂学的研究技术，开展花生黑腐病检测技术与防治方法的研究。设计检测花生黑腐病菌的特异引物，建立常规PCR技术，快速准确地检测潜在花生黑腐病菌的分子检测方法。测量20多种杀菌剂对花生黑腐病菌的抑菌作用，得出不同杀菌剂的EC50。筛选出对花生黑腐病菌有较好抑制作用的杀菌剂，并试验性进行温室药效试验。建立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线等均属国内首创。因此，本研究将为中国华南地区花生黑腐病防治等提供理论与实践基础。可以设想，如能取得预期效果，经过良好设计的基础研究后

4、，可进一步了解花生黑腐病入侵为害等核心科学问题，及时遏制花生黑腐病的蔓延，保护我国花生和大豆产业。项目研究目标2022/9/1861965花生黑腐病由病原真菌Cylindrocladium parasiticum (Bell & Sobers, 1966; Crous et al., 1993)引起，属于半知菌亚门的柱枝双孢霉属，病原菌最早由Bell和Sobers于1965年在美国Georgia州发现和报道，该病菌侵染花生的茎基部、荚果和根系，受侵染部位常常变黑腐烂，最终导致全株萎焉和死亡12。该病害短时间内在美国迅速蔓延扩展和流行，造成的产量损失超过50%3。现状分析2022/9/18719

5、68花生黑腐病菌的寄主十分广泛，可以侵染花生、大豆、红三叶、美丽鹧鸪豆、紫花苜蓿和猪屎豆等十几种豆科植物。花生黑腐病菌在大豆上引起的病害通常称为大豆红冠腐病（Soybean red crown rot）。1968年在日本千叶县首次发现该病，这是世界上最早的关于花生黑腐病菌为害大豆的报道5。该病害在全日本各地区广泛发生，且为害严重，成为日本大豆的重要病害6。在中国江苏、云南和广东等地区曾报道发现大豆红冠腐病8910。花生黑腐病菌可侵染镰果灯心草，这种豆科杂草是危害美国东南部大豆产业的恶性杂草11。花生黑腐病菌还可侵染蓝莓、番木瓜、猕猴桃和花烛等非豆科植物12131415。现状分析2022/9/1

6、8820092009年，潘汝谦等在广东省多个花生产区报道发现花生黑腐病，部分地区危害严重，根据花生黑腐病在世界主要分布现状，我国华南地区正是适宜花生黑腐病发生的地区，所以，应该警惕花生黑腐病的入侵19。现状分析2022/9/189项目研究目标利用特异引物，建立常规PCR体系，快速准确地检测潜在花生黑腐病菌的分子检测方法。试验性开展多重PCR和实时PCR技术检测花生黑腐病菌。测量30多种杀菌剂对花生黑腐病菌的EC50。建立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线。在核心期刊上发表较高水平论文12篇。2022/9/1810项目研究内容设计检测花生黑腐病菌的特异引物，建立常规PCR技术，快速准确地检测潜在花生

7、黑腐病菌的分子检测方法。测量30多种杀菌剂制剂和10种杀菌剂原药对花生黑腐病菌的抑菌作用，得出不同杀菌剂的EC50。筛选出对花生黑腐病菌有较好抑制作用的杀菌剂，并试验性进行温室药效试验。建立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线。2022/9/18111.供试的40个菌株，其中花生根腐病类12个，由华南农业大学杀菌剂与抗菌化合物研究室提供。其编号、种名、采集地点及寄主详见表2-1。Code no.SpeciesOriginHost1Diplodia gossypinaGuangdongPeanut2Rhizoctonia solaniGuangdongPeanut3Sclerotium rolfsii

8、JiangxiPeanut4Aspergillus nigerGuangdongPeanut5Pythium myriotylumGuangdongPeanut6Fusarium solaniGuangdongPeanut7Fusarium oxysporumGuangdongPeanut8Rhizopus arrhizusGuangdongPeanut9Selerotinia miyabeanaGuangdongPeanut10Sphaceloma arachidisGuangdongPeanut11Verticillium dahliaeGuangdongPeanut12Macrophom

9、ina phaseolinaGuangdongPeanut13Neocosmospora vasinfectaJiangxiPeanut14Fusarium oxysporum f. sp. cubenseGuangdongBanana15Thielaviopsis paradoxaGuangdongPineapple16Colletotrichum musaeGuangdongBanana17Colletotrichum gloesporioidesGuangdongMango18Penicillium italicumGuangdongOrange19Penicillium digitat

10、umGuangdongOrange20Fusarium oxyporum f. sp. niveumGuangdongWatermelon21Curvularia lunataGuangdongCorn22Peronophythora litchiiGuangdongLichi23Rhizoctonia solaniGuangdongRice24Pestalotiopsis mangiferaeGuangdongMango25Bipolaris maydisGuangdongCorn表2供试菌株编号及采集地点Note: Neocosmospora vasinfecta is a new pla

11、nt pathogen we found in Guangdong and Jiangxi provice, including two kinds of varieties: Neocosmospora vasinfecta var. Africana and Neocosmospora vasinfecta var. vasinfecta2022/9/1812特异引物见下表。2022/9/18132022/9/18142022/9/18152022/9/18162.采用药皿抑菌法测定杀菌剂的EC50。测定18种杀菌剂对花生脚腐病菌的抑制作用。将花生黑腐病菌于PDA培养基上25预培养7天,用

12、直径6mm的打孔器在靠近菌落边缘的同一圆周上打取菌饼,接种到含有不同药剂浓度的培养基平板上,每皿一片,置于25恒温箱内黑暗培养7天,用十字交叉法测定各处理的菌落生长直径,以清水为对照。每浓度处理重复4次。按照公式求出各个药剂浓度对菌丝生长抑制率(%)。所得数据经Finney概率分析后用DPS统计软件求出毒力回归方程式及EC50。菌丝生长抑制率(%)=1-(处理菌落直径-菌饼直径) /(对照菌落直径-菌饼直径)1002022/9/1817表3 拟采用的杀菌剂原药名录 2022/9/1818名称制剂规格厂家霉克定可湿性粉剂2亿个/克山东嘉禾化工有限公司噻菌铜悬浮剂20%浙江龙湾化工有限公司枯草芽孢

13、杆菌可湿性粉剂1000亿芽孢/克黑龙江强而生化技术开发有限公司蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂300亿个/克香港帅克化学国际有限公司儿茶素可湿性粉剂1%黑龙江平山林业制药厂咪唑喹啉铜可湿性粉剂50%上海绿油油化工有限公司吗孤乙酸铜可湿性粉剂20%齐齐哈尔华丰化工有限公司嘧菌酯悬浮剂25%英国先正达作物保护公司腈苯唑悬浮剂24%英国陶氏益农公司烯唑醇可湿性粉剂12%安阳市国丰农药有限公司苯醚甲环唑水分散粒剂10%深证诺普信农化工有限公司咪鲜胺锰盐可湿性粉剂50%德国拜耳作物科学公司代森锰锌WP80%江苏新中兴化工有限公司代森联水分散粒剂70%德国巴斯夫欧洲公司甲基硫菌灵可湿性粉剂70%河北石家庄市伊诺生化

14、有限公司福美双水分散粒剂80%新加坡立农溴菌腈可湿性粉剂25%江苏托球农化工有限公司嘧霉胺可湿性粉剂25%浙江禾本农药化学有限公司腐雷利可湿性粉剂50%英国汉特生物科技（北京）发展有限公司丙森锌可湿性粉剂70%德国拜耳作物科学公司中生菌素可湿性粉剂3%福州凯立生物制品有限公司三唑酮可湿性粉剂15%江苏剑牌农药化工有限公司多菌灵可湿性粉剂80%太仑市农药厂噁霉灵内吸性土壤杀菌剂99%延边西爱斯开化学农药厂氟硅唑乳油40%深证诺普信农化工有限公司戊唑醇悬浮剂43%拜耳作物科学（中国）有限公司氢氧化铜可杀得46%上海杜邦农化有限公司异菌脲悬浮剂25%深证诺普信农化工有限公司丙环唑乳油25%深证诺普信

15、农化工有限公司百菌清悬浮剂40%深证诺普信农化工有限公司乙唑醇微乳剂5%广东省惠州市中讯化工有限公司腈菌唑乳油12%深证诺普信农化工有限公司表4 拟采用的杀菌剂制剂名录2022/9/18193.通过花生黑腐病菌对嘧菌酯的敏感性检测及抗药性风险的研究，有助于明确花生黑腐病菌是否对该杀菌剂产生抗药性及抗药性风险大小。供试花生黑腐病菌株来自华南农业大学植物病理系杀菌剂与抗菌化合物实验室。不同地理分布菌株65株。菌株编号及地理分布（略）。2022/9/1820拟解决问题建立快速检测花生黑腐病菌的常规PCR技术。筛选出对花生黑腐病防治效果好的杀菌剂，应用于生产实践。2022/9/1821技术路线花生黑腐

16、病分离鉴定典型菌株检测广东省花生病害样品采集普通PCR菌体直接PCR花生种子PCR土壤样品PCR实时PCR引物浓度影响退火温度影响灵敏度检验多重PCR退火温度影响不同引物组合灵敏度检验杀菌剂筛选敏感性基线2022/9/1822预期成果建立一种在花生繁殖材料等植物材料中，在花生种子中，设计检测花生黑腐病菌的特异引物，建立常规PCR技术，快速准确地检测潜在花生黑腐病菌的分子检测方法。测量20多种杀菌剂对花生黑腐病菌的抑菌作用，得出不同杀菌剂的EC50。筛选出对花生黑腐病菌有较好抑制作用的杀菌剂，并试验性进行温室药效试验。建立一种杀菌剂（拟定为嘧菌酯）对花生黑腐病菌敏感性基线。在核心期刊上发表高水平

17、论文12篇。2022/9/1823项目特色与创新之处花生黑腐病菌Cylindrocladium parasiticum (Bell & Sobers, 1966; Crous et al., 1993)列为国家进境植物检疫性病原菌。国内对该病害的报道很少，我们以国家检疫性病原菌为材料，开展花生黑腐病检测技术及防治策略的研究，在国内为首次进行。现在检疫部门对花生黑腐病菌检测主要靠选择性培养基，灵敏度差，特异引物将推动快速检测花生黑腐病菌技术的发展。建立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线也为首次进行。2022/9/1824参考文献1 Bell D. K. ,Sobers.E. K. 1966.A pe

18、g, pod, and root necrosis of peanuts caused by a species of CalonectriaJ. Phytopathology 56:1361-1364.2 Crous. P.W, Wingfield .M.J., Alfenas. A. C. 1993. Cylindrocladium parasiticum sp.nov.,a new name for C.crotalariaeJ.Mycol.Res. 97,889-896.3Porter .D. M. , Wright .F.S., Taber .R.A. et al. 1991. Co

19、lonization of peanut seed by Cylindrocladium parasiticumJ. Phytopathology.81:896-900.4 Dong W. B. ,Brenneman T. B. ,Holbrook .C. C. et al.2009. The interaction between Meloidogyne arenaria and Cylindrocladium parasiticum in runner peanutJ. Plant Pathology 58:7179.5 Misonoo Yoon . 1973. New disease o

20、f soybean and legume Nanjing fanatic are caused by Calonectria crotalariae black root rot Disease J. Plant Protection 27: 77-82.(in Japanese)6 Nishi Humikazu. 2007. Rot fungus soybean black rot Calonectria ilicicolaJ. MAFF Microorganism Genetic Resources Manual No. 21:1-13. ( in Jananese)7 Kuruppu P

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25、sed by Calonectria ilicicola in IranJ.Plant Disease.94:27816Krigsvold, D.T., Griffin, G.J., and Hale, M.G. 1982. Microsclerotial germination of Cylindrocladium crotalariae in the rhizospheres of susceptible and resistant peanut plants. Phytopathology. 72:859-864.17 Phipps, P.M. and Beute, M.K. 1979.

26、 Population dynamics of Cylindrocladium crotalariae microsclerotia in naturally-infested soil. Phytopathology 69:240-243.18 Kucharek TA .2000.Cylindrocladium black rot (CBR) of peanut, soybean,and forage legumes in Florida. Plant Pathology Fact Sheet, University of Florida. 19 潘汝谦，关铭芳，徐大高. 警惕花生黑腐病菌的入侵. 植物保护. 2011 37 (1): 164-165 20