RNA探针杂交步骤以及效价测定

1、RNARNA探针杂交步骤以及效价测定RNA 探针是一段单链cDNA 分子，本文总结了RNA 探针的分类、制备方法、探针的纯化、杂交前的留意事项，RAN探针效价的测定以及探针的选择。RNA 原位杂交中的探针(一)探针的种类RNA 探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链 cDNA 或cRNA RNA 杂交中所使用的探针依其来源可分为三种cDNAcRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。单链cDNA 探针：由于 cDNA 中不存在内含子及其它高度重复序列，又抑制了双链cDNA 探针在杂交反响中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反响的敏感性。但由于单链 cDNA 探针的制备比较困

2、难，在RNA 原位杂交中已很少见有应用。cRNA 探针：是以 cDNA 为模板，通过体外转录而获得的。由于它是一种单链探针，因此也避开了应用cDNA 探针做杂交反响时存在的两条链之间的复性问题。cRNA RNA 之间形成的杂cDNA-RNA 杂交体稳定。cRNA-RNA 之间形成的杂交体不受RNA 酶的影响。因此杂交反响后可用RNA cRNA 探针具有以上这些优点，cRNA 探针的杂交饱和水平又比双链DNA 探针高出8 cRNA 探针的缺点是：探针的制备过程比较简单，需要较好的分子生物学试验设备，它对RNA 酶敏，易受破坏，操作中要防范RNA酶污染。寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸

3、为原料，通过DNA 合成仪合成，避开了真核细胞中存在 与 mRNA 形成的杂交体不如cRNA-RNA 杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括 3H、35C、32P 125I 等，不同的同位素探针其穿透力、定位和半衰期各不一样，无一种同 境和危害安康等缘由，在RNA 原位杂交中应用同位素标记探针已日趋削减，而非同位素标 高辛标记的 cDNA、RNA 和寡核苷酸探针，不但具有生物素标记优点，还抑制了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干扰等缺点，其应用越来越广泛。(二)探针的标记在 RNA

4、 原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法有酶反响法和化学反响法。酶反响法：用于RNA 探针的酶反响法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线DNA RNA 5”3”端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。体外转录法：体外转录法是一种制备与片段序列一样的单链RNA 探针的方法。进展体外转录时，先将靶核苷酸序列转入到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA 聚合酶的作用下，以DNA 为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进展转录，而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转

5、录启动子，如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体T3、T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多位点的两侧将质粒线性化。SP6 噬菌体的RNA 聚合酶对SP6 启动子序列具有高度的亲和性，从而启动4 种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA 聚合酶存在的条件下，即转录成RNA。如反响物中含有标记的三磷酸核糖苷核，全部的RNA 就被标记。 为直接标记法和间接标记法。 已发表的文献说明，由于检出杂交信号受到多种因素抑制，只能限于靶RNA 丰富的细胞或组织中，RNA 杂交对低拷贝的基因检测不抱负。近年来间接标记法得到较快进展，先将标记物结合在探针上，通过特异性识别，由特异性结合多种酶，对检测的杂交信号作用

6、放大， 这一类标记法已呈现极好的进展前景。(三)探针的纯化被结合到探针中去的剩余dNTP 等小分子。为将掺入并结合到cDNA、cRNA 和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进展纯化。乙醇沉淀法的原理是：DNA DNA dNTP 此反复乙醇沉淀能将两者分开。核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质 变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。由于酚虽能有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA 1015% ploy(A)RNA面的局限，混合使用酚与氯仿，对于RNA 提取显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。

7、(四)杂交前预备载玻片和盖玻片的处理为有效防止外源性RNA 酶的污染，杂交用的载玻片和盖玻片可按以下步骤处理。5% 12 小时，用354030min，再3 5min180 烤箱内烘烤 46 小时，盖玻片可按近期内所需量，用铝箔纸包裹后烘烤后存放。片建议用明胶粘附剂，活检或较小的标本建议用多聚左旋赖氨酸或硅烷粘附剂。明胶涂片制备10 1000 40504 25% 硫酸铬钾溶液(chromium potassium sulfate CPS) ，使CPS 0.1%。将烘烤后的载玻片10min1% 多聚甲醛，pH7.4PBS 10min;1% 多聚甲醛，pH7.4 的PBS 10min，在室温下枯燥玻

8、片。60 烤箱内过夜备用。多聚左旋赖氨酸涂片的制备24mg 多聚左旋赖氨酸，分子量在300000 以上，溶于1ml 消毒去离子水中。经旋涡器反复搅拌，吸取2030l 滴加到玻片一侧，再取另一张载玻片复合，将赖氨酸溶液均匀涂抹在裱组织切片处，并将涂有粘附剂的一面用铅笔标出，室温下枯燥切片后，在 60烤箱内过夜备用。硅烷涂片的制备5 毫升氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane APES)250ml 丙酮内。将60min，用双蒸水漂洗2 次，每次10min 枯燥玻片后，60烤箱内过夜备用。留意事项：制备便利为原则，在制备过程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮

9、肤上的RNA 酶的污尽快使用，防止赖氨酸解聚而失效。颖标本的储存和冰冻切片制备为 RNA 原位杂交作颖标本储存和冰冻切片过程中，应严防RNA 酶的污染，制备过程中所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用 0.1% 焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonateDEPC)水清洗。RNA 1.51.2cm 0.2cm，应快速4% 424 30% 蔗糖PBS 溶液内，4 冰箱内过夜。次日可将标本储存于-80 或-140 超低温冰箱内保存。如作冰冻切片，先将组织在-20恒冷切片机内停留，待温度上升后，然后在恒冷冰冻切片7m 402 小时后储存在-80 或-140 超低温冰箱内备用。标本的固

10、定和石蜡切片的制备石蜡切片作RNA 原位杂交的，也应严防RNA 酶的污染，容器、刀具等去除RNA 酶的过程同冰冻切片。为防止RNA 快速降解，离体后标本应马上有效固定。为保存良好组织构造，有利探针的穿透力，应选用适宜的固定剂。 长时间固定可引起RNA 降解。其缺乏之处是：组织形态构造的保持不如交联固定剂。交联固定剂能较好保存组织中RNA 和组织形态构造，但固定时间过长，也可发生胞浆和胞核内大分子化合物形成交联，影响探针的穿透力，阻碍杂交体的形成。4%多聚甲醛固定液4g 0.25g 100ml 0.01mol/L pH7.0 PBS 溶液，组织在常温下浸4% 4 小时，每1 10min4 0.0

11、1mol/L pH7.0的PBS 2 30min。福尔马林醋酸固定液50% 酒精、10% 5% 醋酸组成。在常温下将组织浸泡41 10 4 50% 酒精漂2 30min。(五)杂交前探针的选择RNA 探针：RNA 50150 500 个20 500 RNA 探针则在杂交前用有限碱基水解法把握其长度。t=Lf- Lo/ K LoLf (Lo=核酸探针原长度(kb)，Lf=核酸探针水解后所需长度(kb)，K是常数率=0.11kb/min)。在室温中参加以下终止水解：3mol/L 醋酸钠，6.6l(0.1mol/L)1.3l(终浓度0.5%)。 ) 2 1400rpm 30min。留神将乙醇倒出，待

12、试管内枯燥后再用无菌ddH2O 10ng/l 浓度。(5)10% 60 的尿素中电泳检测。探针的长度 度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA 探针的浓度为 0.5ng/l，而非放射性标记cRNA 探针的浓度 1.0ng/l。杂交液的量要适当，每张切片以3050l 为宜。保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必需彻底，应用杂交罩等也很必要。杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是RNA (meltingtemperature Tm)20-30。多数RNA 原位杂交Tm 95，由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的粘附将产Tm 1% 甲酰胺浓度可降低 0.72。另外杂交体中

13、GC 的百分比、杂交体长度以及杂交液中 Na+的浓度也与Tm呈正相关。 长会增加非特异性着色。一般RNA 原位杂交承受杂交孵育过夜，在黑暗环境下进展，可以避开光线对甲酰RNA 探针的制备样本DNA 的性质1、 纯度：高纯度质粒提取试剂盒提取并纯化2、 大小：100bp-10kb10kb 需要限制性内切酶的酶切3、 含量：1ug DNA10ug 标记RNA样品制备1、 在克隆插入位点下游，使用限制性内切酶将质粒线性化2、 为了避开不需要序列的转录，使用限制性内切酶对5段进展修饰3、 酶切后，使用高纯化的PCR 产物纯化试剂盒纯化或工作液的预备溶液 预备 储存 用途水：PCR 0.1% 15-25

14、 调整溶液体积或DMPC 处理水 methylpyrocarbonate resuspend RNAEDTA 0.2M ethylene-diamino- 15-25 终止反响Tetraacetic acid, pH 8.0步骤标准RNA 标记反响1、1ug 纯化的模版DNA 4ul 比照DNA 13ul 体系2、将反响物均放在冰上，然后参加以下试剂：10 NTP labeling mixture 2ul10 Transcription buffer 2ul Protector RNase inhibitor 1ulRNA Polymerase SP6 or 2ul RNA Polymeras

15、e T7轻轻混匀并瞬时离心，37孵育 2h。(长时间的孵育并不能增加标记RNA)32ul DNase I，除去模版DNA;3715min(试剂盒可不做此步骤)42ul 0.2M EDTA(pH8.0)终止反响。探针的储存:-15 至-251 年，避开反复冻融标记效率的测定RNA Dilution Buffer：DMPC 处理的ddH2O:20SSC：formaldehyd=5：3：2，颖配制rna探针怎么检测效率问题：我用 DIG 法检测 DNA 含量，可是在探针标记效率检测时，按试剂合说明书稀释 1ng/ul 10pg/ul 3pg/ul 1pg/ul 0.3pg/ul 0.1pg/ul 0

16、.03pg/ul 0.01pg/u4(Lebeled Control DNA )0.03pg/ul的点显色，而且我做的标记效率很低。请教各位，怎样加深Lebeled Control DNA 显色效果和提高探针标记效率? 优化。假设kit 里面带的control DNA 都达不到应有的灵敏度，可能是操作过程有问题，由于 DNA 是标记好的，只剩下与抗体反响和显色两个步骤了，可以从这两步找找缘由。至于 过程，比方DNA 过大的话应当用适宜的内切酶切成小片段，延长标记时间等等，一般标记 也会影响杂交效率。一般的DIG 检测的kit 都是随机引物扩增法标记, 一般都能到达浓度标记的要求.假设确实标记的

17、效率上不去, PCR 直接扩增法进展标记.具体方法是,PCR 的条件(引物5pM/20uL), dNTPs(2.5mM)dATP,dCTP,dGTP,dTTPDIG-dUTP,混合至2.5mM/each(dTTP2mM DIG-dUTP0.5mM), PCR 就好了(PCR 的特异性,再去标记).探针长度机敏,从 100目的片段长度都可以,推举 150300bp 之内.标记的效率很高,lz不妨一试.固然DIG-dUTP 比较贵,但是比重买试剂盒合算, 而且由于标记效率高, 一次PCR 20 微升为例,20100mL, DIG-dUTP可以用到死啊地高辛标记的dna，rna 探针怎么检测效率啊?我做植物原位杂交的，用的探针是地高辛标记的 dna，rna 探针，现在试验没有结果，我想检测下探针的效率，有谁