亚硫酸盐还原菌及检测

1、亚硫酸盐复原菌及检测一、生物学特性与卫生学意义亚硫酸盐复原梭状芽胞杆菌是梭状芽胞杆菌属的一群细菌，而不是一个生物学分类单位。多指厌氧芽胞杆菌，代表性菌株是致黑梭状芽胞杆菌，其他常见的还有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌等。此类细菌的主要特征是将亚硫酸盐复原为硫化物，多为有动力的革兰氏阳性菌，可形成芽胞，厌氧生长。厌氧亚硫酸盐复原菌的孢子在自然环境中广泛存在，通常消灭在人和动物的粪便排泄物，废水和土壤中。与大肠杆菌和其它杆菌不同的是，由于它们的孢子比养分体对物理和化学因子具有更强的抵抗力，所以可以在自然环境中存活很大时间。因而，通常将他们作为长期污染或连续污染的指示菌。它们甚至可以抵抗正常水处

2、理所用氯的工作浓度，因此，它们对推断是否已到达把握目的格外有用。由于此类细菌抵抗力强，即使在经适当加工处理的加工食品中其芽胞仍会存活，条件适宜时又会生长生殖，造成食品品质降低或腐败，甚至会引起食物中毒的危急。因此在食品的制备、贮存以及食品加工厂环境卫生把握上颇受重视，作为食品、矿泉水、加工设备卫生、生产环境的卫生状况的评估指标，正确得到越来越广泛的应用。该类细菌的检测多用于环境水质和生活饮用水污染状况的评估，在九十年月中后期开头在食品卫生领域中有所要求，但多局限于欧洲国家和地区，如法国、瑞士、英国、捷克等欧盟成员国。到目前为止，该菌一般不被作为食品卫生常规检测工程和致病菌检测内容，我国和美国未

3、将该检测工程列入食品微生物检测工程和要求中。二、检测方法由于此类细菌以形成芽胞、厌氧生长和复原亚硫酸盐为硫化氢为主要特征， 往往无需作进一步试验验证，因此在检测中将满足以上三个条件的一群细菌全部认定为厌氧亚硫酸盐复原菌。检测方法一般包括以下三局部：检样在接种前在 80-100水浴中处理 10-15 分钟，以杀灭抵抗力弱的芽胞细菌的养分体，同时刺激芽胞的生殖；通过选择性培育如亚硫酸铁盐琼脂等判定是否具有复原亚硫酸盐的力量，假设有则进一步与培育基中的亚铁盐如枸橼酸铁反响，使菌落呈现黑色；培育基接种后置于厌氧环境中培育确认厌氧特征。也可在培育基中参加抗生素等抑制剂抑制其它非亚硫酸盐复原菌的生长。下面

4、具体介绍亚硫酸盐复原梭状芽胞杆菌的检验方法。培育基和试剂氯化钠胰蛋白胨稀释液亚硫酸铁琼脂过氧化氢试剂仪器和设备均质器:用于处理固体样品培育罐箱,带产生厌氧环境的设备或试剂2.3 恒温培育箱:371或 461振荡器吸管:1mL、10mL,具 0.1mL 刻度培育皿:直径为 90mm稀释瓶:容量为 500mL 和 250mL 的广口瓶天平:感量 0.1g 3.抽样和试样制备抽样参照 SN0330-94 规定抽样试样制备无菌操作称取剪碎后的样品 25g,置于装有 225mL 氯化钠胰蛋白胨稀释液的广口瓶中。假设检测亚硫酸盐复原梭菌的芽胞,可 75 20min 或煮沸保持 10min 热处理样品,之后

5、以流水快速冷却至室温后再称取。充分混匀后据样品污染状况做进一步的系列十倍梯度稀释。检验步骤与计数菌落计数法适用于检查未经加工处理的生鲜食品及亚硫酸盐复原梭菌计数10g(mL)的食品。接种和培育对每一份试样，选用适宜的三个连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸取 1 mL，一式双份地接种于每个灭菌的培育皿中。倾注约 15 mL 制备好的并于水浴箱保温至 45的亚硫酸铁琼脂。从制备最初稀释液完毕到倾注培育基于最终一个平皿所用的时间不应超过 15min。认真将接种物和培育基充分混匀，水平放置，使其凝固。待混合物凝固后，在倾注 10 mL 同样的培育基于已凝固的培育基上作为隔层以防氧吸附，并防止细菌集中生

6、长。待该隔层凝固后反转制备好的平板，于 371厌氧培育 24-48h。假设对培育温度有特别要求如 46，可依据状况进展培育。计数亚硫酸盐复原梭菌在亚硫酸铁琼脂上呈暗灰色或黑色菌落。371厌氧培育 24h 后，计数典型的菌落；假设平板上无特征性菌落或菌落较小0.5mm， 则需连续培育 24h 再计数；假设 48 h 后的菌落增大以至相连，则以 24 h 的计数为准，反之则以 48h 为准。那些仅产生氢而不是 H S的厌氧菌生长时也可复原亚硫酸盐而导致培育2基消灭弥散的、非典型的普遍变黑，这种现象不应计数。取特征性菌落不少于 5 个移种于疱肉培育基中，371厌氧培育24-72 h。待消灭生长特征培

7、育液浑浊、产气、消灭异味后，按 5 条进展证明试验。对阳性结果进展计数。读取带有 10-100 个黑色菌落的平皿，结果以相应稀释度的两个平板的菌落数平均值乘以相应稀释倍数来计算每克样品中亚硫酸盐复原梭菌数。结果报告如下：估量亚硫酸盐复原梭菌数/g(mL)。假设相应测试试样的两个平板上均无特征性菌落，以10/g(mL)报告最近似值MPN法适用于检查亚硫酸盐复原梭菌计数10 g(mL)及含有受损伤的亚硫酸盐复原梭菌的加工食品。接种和培育增菌选用适宜的三个连续稀释的样液，从每个样液中分别吸取 1mL，一式三份地接种于 3 管装有疱肉培育基的试管中,接种后上面掩盖一层无菌的液体石蜡，371培育 24-

8、72h。待消灭生长特征培育液混浊、产气、消灭异味后,按 5.1条进展镜检。反之，则报告阴性。分别培育取 4.2.1.1 增菌培育物 1mL 置于灭菌的培育皿中，倾注约 15mL45的亚硫酸铁琼脂。认真将接种物和培育基充分混匀，待其凝固后，再倾注 10mL 同样的培育基作为隔层，于 371厌氧培育 24-48h。生成的暗灰色或黑色菌落，按5 条加以证明；反之，则报告阴性。结果计算计数每个稀释度得到的阳性反响管数。利用 MPN 表，由阳性管数估算每克毫升试样中亚硫酸盐复原梭菌最近似值。结果报告如下：估量亚硫酸盐复原梭菌数/g(mL)。证明试验形态观看取疱肉培育物涂片，镜检，作革兰氏染色，检查培育物

9、细菌形态。亚硫酸盐复原梭菌为革兰氏阳性杆菌，单个散在，成对、成小链状或并列地聚堆存在。产芽胞时，芽胞呈卵圆形或球形，位于中心、次终端或终端。过氧化氢酶试验在干净载玻片上滴 1 滴培育物，再滴加 1-2 滴 3% 的过氧化氢。消灭小气泡说明有过氧化氢酶活性。亚硫酸盐复原梭菌不形成过氧化氢酶。附录：A1 氯化钠胰蛋白胨稀释液将 8.5g 氯化钠和 1.0g 胰蛋白胨溶解于 1000 mL 蒸馏水中。调整 pH 至 7.20.1。分装 225 mL 于 250 mL 广口瓶中，121高压灭菌 15min。A2 亚硫酸铁琼脂胰蛋白胨 15.0g 大豆蛋白胨 5.0g 酵母浸膏 5.0g偏重亚硫酸钠 1

10、.0g柠檬酸铁铵 1.0g琼脂 20.0g蒸馏水 1000g将各成分混匀，加热溶解，调整 pH 至 7.60.1，分装于 500 mL 锥形瓶中各 250 mL，121高压灭菌 15 min。一周内用完。A3 疱肉培育基牛肉浸液 1000 mL蛋白胨 30.0g酵母浸膏 5.0g 磷酸二氢钠 5.0g 葡萄糖 3.0g可溶性淀粉 2.0g碎肉渣 适量取碎肉渣分装 15mm150mm 试管约 2-3cm 高，将上述液体培育基分装至每管内超过肉渣外表约 1 cm。121高压灭菌 15 min。A4 过氧化氢酶试验挑取培育物一接种环，置于干净载玻片上，滴加 3%过氧化氢溶液临用时配制2mL，于半分钟

11、内观看发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。耶尔森氏菌及检验耶尔森氏菌属包括 11 个种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌和鼠疫菌。只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食源性病原体。鼠疫耶尔森氏菌引起黑疽病，不通过食品传染。1981 年依据 DNA 以及生化和形态特征的相关资料，与小肠结肠炎耶尔森氏菌极为亲热 3 个同源群被作为耶尔森氏菌的种命名，它们是弗氏耶尔森氏菌Yfrederiksenii、中间型耶尔森氏菌Yintermedia和克氏耶尔森氏菌Ykrislensenii。一、生物学特性1、形态特性本菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为 1-3.50.5-1.3

12、m，多单个散在， 有时排列成短链或成堆。本菌不形成芽胞，无荚膜，有周鞭毛；但其鞭毛在 30 以下培育条件形成，温度较高时即丧失，因此表现为 30以下有动力，而 35 以上则无动力。2、培育特性本菌生长温度为 30-37，但在 22-29才能使本菌的某些特性消灭。4时能保存和生殖。本菌世代时间长，最短亦需 40 分钟左右。在 SS 或麦康凯琼脂上于 25经 24 小时培育，菌落细小，至 48 小时直径才增大成 0.5-3.0mm。菌落圆整、光滑、潮湿、扁平或稍隆起，透亮或半透亮；在麦康凯琼脂上菌落淡黄色， 如假设微带红色，则菌落中心的红色常稍深。本菌在肉汤中生长呈均匀混浊，一般不形成菌膜。3、生化特性氏菌表一：本菌的生化特性及其与近缘菌的鉴别反 应鼠 疫耶氏菌假结核耶氏菌小肠结肠炎耶氏菌中间型耶费 氏耶氏菌克 氏耶氏菌赖氨酸-精氨酸-鸟氨酸-+动力(22-26)-+动力(35-37)-尿 素-+苯丙氨酸-脱氨基酶甘露醇+山梨醇+/-+纤维二糖-+核