20160831 毕赤酵母蛋白不表达的原因

1、毕赤酵母蛋白不表达的原因很多朋友问这样一个问题：为什么毕赤酵母不表达?他们自己也很纳闷，重组酵母PCR检测也证明目的基因重组了，但是诱导之后就 是在表达上清中检测不到目的蛋白，仔细研究操作手册后仍然不知道原因。本人，根据自己的经验，采用倒推的方法，按实验过程从后向前分析，供大家参考：1、诱导之后表达上清中检测不到目的蛋白：检测的方法是否有问题，要考虑是不是蛋白表达量低而没有检测到？如果是蛋白表达低，可以选择浓缩蛋白，具体的方法很多，有TCA、丙酮、浓缩柱 等等方法，之前在本版已经发过帖，在此不赘述。：如果蛋白浓缩N倍之后仍然检测不到，那基本可以确证蛋白并不在上清中。那 么蛋白到哪里去了，考虑是

2、否没有分泌出来，而是在胞内，那就需要通过裂解酵母来检 测胞内蛋白，具体的方法很多，在此也不赘述，曾整理过相关破碎的帖子。：如果胞内也没有目的蛋白表达，那么基本可以确定蛋白并没有表达。2、为什么没有表达呢?倒推回来就是诱导的过程了，诱导体系是什么?甲醇 浓度是多少?培养问题是多少，转速是多少?这些都要注意。甲醇一般是0.5%-1.0%，本人用的是0.5%，也有很多人也用1.0%， 曾见过一个帖子，说超过 1.5%反而会抑制表达，没有验证过，供大家参考。培养问题 28-30 度比较合适，转速 250rpm 比较合适，诱导体系没有固定的体系，说明书上推荐的是BMGY到OD600 26,换到BMMY

3、中 OD600 为 1 左右。3、如果诱导的过程也没有问题，那问题就复杂了，特别是重组酵母 PCR 检测证明目的基因确实已经发生了重组。这个时候是最郁闷的了，但是郁闷怎么办，还是要找原因，在此我给的建议是先做 RT-PCR 证明 mRNA 水平的情况，也就是说有没有转录。如果转录了，后续的操作也 没有问题（本帖的 1、 2 项），那么只有重新设计实验，比如换酵母株，有文章上说：用 GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。4、关于毕赤酵母不表达的。有个帖子说的很好，在此和大家分享一下。1、菌株：用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。2、温度： 在 28 度

4、和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。3、pH：手册上用6.0, pH提高到6.8,不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的 PH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右。pH3的时候 yeast 和 peptone 好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。4、偏爱密码子：codon bias 般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要 问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往 往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达 量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pic

5、hia酵母表达一个单链抗体，29KD，含 有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有 什么提高。5、表达时间与空质粒转化对照：诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的， 时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照，这样就会 比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。6、污染：每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃 管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余1ml 换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污

6、染。加盖报纸后， 就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶，装量 10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。7、不表达：蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2-3次实验都没有表达 菌株，这个蛋白就放弃表达了。8、表达量：30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5-10 倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。9、糖基化：酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是 潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1-3KD左右的糖基。另外 可能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很

7、少听说表达蛋白有O糖基化的。 如果胞内表达，不存在糖基化的问题。10、表型与表达：重组Sall和Bglll酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+ 和 Muts 表型的菌株;前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗 的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多， 但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达 较好。11、培养基YPD：最基本的培养用;BMGY：诱导表达前培养用;BMMY：诱导表达用;MD：电 转化后筛选his+用。YEPD 是不能代替 BMGY 的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下

8、一步的 诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡 萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制 甲醇利用。BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用 5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加 100%甲醇至你要的浓度。YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待 培养基高压灭菌后加入配YPD时可以加入YPD 一起灭菌，但时间不能太长，温度不 能太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPD 焦化。 glucose 和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。 颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或 YNB 的培养基 108度 35min 高压灭菌。小量发酵其实可以把培养基成分