过程分子生物学公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件

1、华东理工大学硕士硕士学位课程过程分子生物学张 惠 展第1页分子生物学是生命科学主导性学科基因表示与调控是分子生物学主题思想过程分子生物学是分子生物学理论发展高级阶段1953-1983 基础分子生物学阶段20世纪50年代 DNA双螺旋模型建立20世纪60年代 遗传密码破译20世纪70年代 DNA重组技术诞生1983-？ 过程分子生物学阶段20世纪80年代 动植物转基因技术问世20世纪90年代 人类基因组计划实施二十一世纪代 RNA干扰现象发觉第2页过程分子生物学5 2 3 4 1 6 基因表示调控机制细胞通讯分子机制免疫多样性分子识别胚胎发育基因表示谱肿瘤发生分子机制基因组学与系统生物学第3页基

2、因表示调控机制B C D A E F 原核生物基因表示开启开关真核生物多转录因子协同作用原核生物RNA结构调控真核生物RNA剪切调控原核生物反义RNA调控真核生物sRNA介导RNA干扰G 真核生物应答元件转录调控第4页1A 原核生物基因表示开启开关 经过对100多个大肠杆菌开启子序列分析，结果表明：大多数含有普通生理生化功效基因所属开启子，含有统一特征序列。a 大肠杆菌开启子多样性TTGACAAACTGTTATAATATATTA16 - 10 bp5 - 9 bp结构基因转录起始位点-35区 T82T84G78A65C54A45-10区 T80A95T45A60A50T96开启子一个经典大肠杆

3、菌开启子通常包含以下四个结构要素： 第5页1A 原核生物基因表示开启开关 绝大多数原核生物RNA聚合酶均由五个亚基组成：a2bbs（全酶），其中a2bb称为（关键酶）。各种原核细菌a、b、b亚基呈高度同源性，唯独s因子差异较大。RNA聚合酶关键酶对DNA链含有非特异性亲和力（碱性蛋白与酸性DNA之间静电引力），但s因子增强了RNA聚合酶与开启子区域特异性结合。s因子帮助RNAa 大肠杆菌开启子多样性聚合酶识别开启子，同时开启转录。第6页大肠杆菌开启子与s因子对应关系rpo D普通生理生化TTGACATATAATrpo H热休克CCCTTGAACCCGATNTrpo N氮源摄取代谢CTGGNAT

4、TGCAfli A鞭毛生成CTAAAGCCGATAA基因分子量-35区序列70,00032,00054,00028,000性质间隔区16-18 bp13-15 bp6 bp15 bp-10区序列第7页1A 原核生物基因表示开启开关 枯草杆菌中存在着大约十类不一样开启子，其中有些隶属于正常生理代谢基因，有些则隶属于噬菌体感染、孢子生成、次级代谢过程中相关基因。 b 枯草杆菌开启子多样性第8页在SPO1噬菌体感染过程中RNA聚合酶及其s因子 SPO1噬菌体感染枯草杆菌后，早期基因表示；4-5分钟后，中期基因表示，早期基因关闭；8-12分钟后，晚期基因表示，中期基因关闭。早期基因开启子由s43识别开

5、启，这是枯草杆菌细胞内含有广泛生理生化功效s因子，与大肠杆菌中s70同源，组成a2bbs43型RNA聚合酶，转录中期基因表示所需s因子编码基因gp28。中期基因开启子由sgp28识别开启，它与枯草杆菌关键酶组成a2bbsgp28型RNA聚合酶全酶，负责转录晚期基因表示所需s因子编码基因gp33和gp34。晚期基因开启子由sgp33和sgp34识别开启，分别组成RNA聚合酶全酶a2bbsgp33和a2bbsgp34。第9页SPO1噬菌体基因表达级联调控模式经过更换不一样s因子，识别并作用于不一样基因开启子，最终造成这些基因有次序地级联表达。前一基因编码后一基因表示所需s因子。第10页枯草杆菌孢子

6、生成过程 枯草杆菌在对数生长阶段结束后，培养基中营养物质耗尽，这时便开启孢子生成过程：先是DNA复制，隔膜形成，孢衣合成，母体裂解，孢子释放。最终在细胞内约40%mRNA是孢子生专一性。第11页枯草杆菌孢子形成过程中RNA聚合酶及其s因子 当环境压力（例如营养成份枯竭）时，枯草杆菌细胞内发生一连串磷酸基团传递反应，最终导致转录调控因子SpoOA磷酸化。磷酸化了SpoOA同时启动两种不一样操纵子转录，分别表达出sproE和sF。sF一方面启动sG表达，其次又激活SpoIIR，后者再激活隔膜结合型蛋白SpoIIGA，活化了SpoIIGA将母体细胞中表达sproE裂解为有活性sE；而在前孢区域内产生

7、sE均被前孢特有蛋白酶摧毁殆尽。母体细胞中sE活性是激活前孢区域sG所必需（经过SpoIIA和一种未知蛋白因子）；而sG活性又能产生一种信号，跨隔膜激活母体细胞中sK。即：sF sE sG sK 。第12页枯草杆菌孢子子交叉激活形成过程中两种路径 s因sFsEsGsK激活表示前孢区母细胞SpoOASpoOAs43s43sFsproEsEsGsK隔膜第13页1A 原核生物基因表示开启开关 链霉菌开启子结构含有很大离散性，经过对100多个开启子序列比较，可将链霉菌开启子分成三大类： c 链霉菌开启子多样性 含有经典原核生物开启子-10区和-35区特征开启子，仅占21% 含有经典原核生物开启子-10

8、区而无保守-35区开启子 既无经典原核生物开启子-10区又无保守-35区开启子第14页1A 原核生物基因表示开启开关 天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）全基因组中存在多达65种不一样s因c 链霉菌开启子多样性s66（hrdB） 链霉菌最主要s因子，hrdB-突变是致死性。hrdB基因全程表示，称为看家基因。sWhiG（whiG） 链霉菌次级代谢基因转录所需s因子。sF链霉菌孢子生成基因转录所需s因子。sBldN（bldN）链霉菌气生菌丝发育基因转录所需s因子。sR（sigR）链霉菌响应氧化压力基因转录所需s因子。sE（sigE）链霉菌感应细胞膜完整性功效所需s因子。

9、子，其中已被判定有：第15页1B 真核生物多转录因子协同作用 真核生物尤其是高等真核生物（哺乳动物）因为其细胞高度分化，决定了基因转录调控机制复杂性。 与原核生物不一样，哺乳动物细胞内共有三大类RNA聚合酶系统，它们均由多转录因子组成，识别三大类真核生物开启子，分别负担rRNA、mRNA、tRNA转录。全部三种RNA聚合酶均由8-14个亚基组成，500kD，但它们并不能单独开启基因转录。第16页1B 真核生物多转录因子协同作用开启子由两部分元件组成。a RNA聚合酶 I 开启转录程序 RNA聚合酶 I 定位于核仁，负责转录rRNA编码基因。RNA聚合酶 I 只作用于一个类型开启子，这类第17页

10、高等真核生物 I 型开启子结构结构基因I 型开启子转录起始位点上游控制序列（UCE）关键开启子GC丰富区GC丰富区增强开启效果开启基因转录CTCCGAGTCGNNNNNNNTGGGCCGCCGG 人类这两个重复序列含有85%同原性第18页I 型开启子介导rRNA基因转录开启过程RNA聚合酶 I 在 I 型开启子处定位需要两种转录因子并经历三个阶段：UBF1（UCE结合因子）装配因子SL1（四聚体蛋白复合物）定位因子其中之一为TBP第19页1B 真核生物多转录因子协同作用 RNA聚合酶 II 定位于核内，负责转录mRNA前体分子hnRNA。 RNA聚合酶 II 及其作用 II 型开启子是真核生物

11、细胞中最广泛最经典最主要转录开启元件。b RNA聚合酶 II 开启转录程序第20页高等真核生物 II 型开启子结构结构基因II 型开启子转录起始位点开启子附加区TATA BOX转录开启效率转录因子和RNA pol II 识别位点转录时空特异性开启基因转录转录起始子 Inr第21页高等真核生物 II 型开启子结构结构基因II 型开启子转录起始位点开启子附加区TATA BOXInrOCT BOXATTTGCAT单向性Oct 因子激活GC BOXGGGCGG双向性SP1 因子激活CAAT BOXGGCCAATCT双向性CTF/NF1 因子激活上述附加区元件并不一定同时存在，而且在间隔、排列次序、拷贝

12、数上都有很大可变性。第22页高等真核生物 II 型开启子结构结构基因II 型开启子转录起始位点开启子附加区TATA BOXInr TATA BOX 位于 -25区，普遍存在于全部真核生物细胞中，由八对碱基组成，两侧为GC碱基对。少数不含TATA BOX 特征结构开启子成为 TATA-less 开启子。第23页RNA聚合酶 II 与转录因子复合物装配因子TF II A B E F H J RNA聚合酶 II 本身由十个以上亚基组成 ，这些亚基含有类似于原核细菌RNA聚合酶中a、b、b 亚基功效，但一样不能识别开启子。对开启子专一性识别由一系列转录因子负责。这些转因子分为两大类：装配因子和定位因子

13、。 定位因子聚合酶 IITBP TAFa2bbs 因子真核生物： 原核生物： 第24页II 型开启子介导基因转录开启过程 各种转录因子和RNA聚合酶 II 依次结合在DNA及其蛋白质复合物上，每种蛋白因子结合均使DNA-蛋白质复合物空间构象发生一次改变，而这种构象改变又是下一轮蛋白因子加入所必需第25页RNA聚合酶 II 在近开启子处暂停介导转录延伸调控机制 以RNA聚合酶 II 为关键转录因子复合物在 II 型开启子处装配完成后，转录开启。但随即转录进程并非像人们想象那么一帆风顺。实际上在很多果蝇和哺乳动物基因中，刚才开启转录RNA聚合酶 II 会在转录起始位点下游20-50个碱基处停顿下来

14、。一些蛋白因子促进RNA聚合酶 II 快速进入停顿位点，而NELF（负延伸因子）和DSIF因子则起到稳定处于停顿状态聚合酶 II 作用。快速进入停顿位点慢速逃离停顿位点第26页RNA聚合酶 II 在近开启子处暂停介导转录延伸调控机制 RNA聚合酶 II 从停顿位点逃离先决条件是一些能促进其逃离蛋白因子出现。这些因子将正转录延伸因子b（P-TEFb）招募至RNA聚合酶 II 处，并使NELF磷酸化。被磷酸化NELF从RNA聚合酶 II 上解离，后者得以逃离，转录加速；反之转录将迟缓进行。Science 319，1791，第27页1B 真核生物多转录因子协同作用 RNA聚合酶 III 定位于核内，

15、负责转录tRNA和小分子 核内RNA（snRNA）。对应 III 型开启子有两种类型： tRNA编码基因所属开启子称为内源型开启子； snRNA编码基因所属开启子称为外源型开启子；c RNA聚合酶 III 转录开启程序第28页高等真核生物 III 型开启子结构结构基因III 型内源型开启子转录起始位点BOX ABOX CBOX ABOX BPSEOCTPol III 结合区III 型外源型开启子转录起始位点结构基因第29页III 型开启子介导tRNA/snRNA基因转录开启过程TFIIIB由TBP和另外两种蛋白因子组成，其功能相当于定位因子；TFIIIC和TFIIIF属于装配因子。boxAbo

16、xCboxAboxB转录起始位点（1型）转录起始位点（2型）TFIIIATFIIICTFIIIATFIIICTFIIICTFIIIATFIIICTFIIICTFIIIBTFIIIBRNA Pol IIIRNA Pol IIITFIIIBTFIIIB第30页1B 真核生物多转录因子协同作用 由此可见，TBP是全部三种类型RNA聚合酶转录系统所必需。在含有TATA BOX开启子中，TBP特异性地结合在DNA对应区域；在TATA less 型开启子中，TBP与其它蛋白因子协同作用，结合在DNA特定区域内。 第31页1C 原核生物RNA结构调控 RNA结构调控是一个转录开启后基因表示调控方式，其主要形

17、式表现为转录终止与抗终止作用。 a RNA转录终止作用 原核细菌拥有两种机制终止RNA聚合酶转录，它们分别称为顺式终止和反式终止。 第32页介导转录顺式终止内源性终止子 内源性终止子结构组成为富含GC碱基发夹结构以及下游寡聚U链（通常是6个U）。它们由DNA上终止子序列编码，出现在转5 A U C G CA UA UU AC GC GC GG CA UA UA UC GA GG CU AU AC UC GG CG CG UA AG G U A A UG URNA聚合酶U U U U U U 3 录中RNA结构中。 真核生物转录终止机制也与顺式终止相同。 第33页介导转录反式终止Rho因子依赖性

18、终止子 基因转录反式终止多见于噬菌体中。终止位点为CUU中某个碱基，其上游 50-90 bp 序列中无茎环发夹结构，但碱基组成特殊：C 41%，G 14%，A 25%，U 20%。在这种Rho（r）因子专一性识别终止子结构内，若缺失若干个C，甚至一个C，便会造成不能终止RNA聚合酶Rho因子识别结合区5 AUCGCUACCUCAUAUCCGCACCUCCUCAAACGCUACCUCGACCAGAAAGGCGUCUCUU 3 现象发生。第34页反式终止机制 Rho因子呈六聚体，含有ATPase活性。当RNA聚合酶转录出富含CRho因子识别位点时，Rho因子便与转录出RNA链结合； Rho因子沿R

19、NA链向RNA聚合酶方向移动，因为其移动速度快于RNA聚合酶，所以当RNA聚合酶转录出终止位点CUU时，Rho因子恰好赶上； Rho因子水解ATP释放能量，拆开DNA-RNA杂合链，转录遂终止。但若在Rho因子与RNA聚合酶之间存在着核糖体，则Rho因子不能终止转录第35页1C 原核生物RNA结构调控b RNA转录抗终止作用 在一些特殊条件下，由RNA聚合酶引导转录并不能在终止子处顺利终止，这种现象称为“转录过头”，其发生 RNA结构调控是一个转录开启后基因表示调控方式，其主要形式表现为转录终止与抗终止作用。 机制是细胞内转录抗终止作用。第36页细菌衰减子依赖性转录抗终止作用UGGUGGCGC

20、ACUUCC5 UGAAACAUGUGACGGUGGAUACCCAGCCCGCCUUACGAAAGCAAUCAUCCAGCUAAUGAGUCGGGUUUUUUUCUGGUGGCGCACUUCCUGAACC5 ACUAUGUGACGGGUCAAUGCGUAAAGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCCUCGGGCGGAUUAAUUUUUUU 3 3 另一个则位于正常基因编码区下游。细胞内条件改变，可使基因转录在两个顺式终止子结构某一个处终止。这种结构称一些细菌结构基因含有两个顺式终止子，其中一个位于基因上游编码区内，为衰减子。相互转换第37页细菌衰减子转录抗终止机制大肠杆菌色氨酸操纵子中含有一

21、个衰减子结构。在基因5端编码区有两个连续排列色氨酸密码子。当细胞内色氨酸匮乏时核糖体在色氨酸密码子处暂停翻译，衰减子2链和3链形成双链结构，第一个终止子结构不能形成，转录继续进行；当细胞内色氨酸充分时，翻译不在色氨酸密码子处停顿，结果产生终止子结构，转录遂终止。第38页噬菌体抗终止因子依赖性转录抗终止作用 大肠杆菌 l 噬菌体早早期基因和早期基因表示产物往往是晚期基因表示调控因子。早早期基因表示产物调控机制有两种： 一是作为 s 因子识别早期基因和晚期基因开启子，开启表示这两组基因；二是作为转录抗终止因子，使宿主细胞RNA聚合酶转录过头，造成早期基因和晚期基因表示。这两种方式均为正调控作用。第

22、39页噬菌体抗终止因子作用 大肠杆菌l噬菌体感染大肠杆菌后，在PL开启子介导下表示出抗终止因子N蛋白，它以一个独特方式使阻止Rho因子转录终止作用，使早早期基因转录过头并转录出早期基因mRNA N蛋白半衰期只有五分钟，它决定了早期基因表达周期长短。tL1tR1PLPRNcro左向转录单位右向转录单位抗终止因子 NtL1tR1第40页抗终止因子工作原理 大肠杆菌 l 噬菌体抗终止因子N特异性识别早早期基因内部nut位点，而且在RNA聚合酶抵达这里时与之结合，形成复合物。这种复合物能有效抑制Rho因子结合作用，从而干扰Rho因子介导转录终止效应，造成早早期基因转录过头 Q因子以类似机制使得早期基因

23、转录过头。开启子终止子RNA聚合酶nut 位点r 因子NusB / S10NusANCGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCAGCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyTTCCCGT第41页1D 真核生物RNA剪切调控 真核生物大多数分裂基因（即含有内含子基因）在转录后必须切除内含子序列。正常剪切时，外显子序列和个数是恒定不变；但有些基因转录产物会出现剪切多样性，即一个基因转录物产生各种不一样mRNA其中包含外显子取代、加入、缺失。甚至在一些细胞内，这些因为剪切多样性而产生不一样蛋白质会同时出现， 而且均为细胞正正常生物功效所必需。 第42页GUAGG

24、UAGGUAGGUAGGUAGGUAG正常剪切模式异常剪切模式第43页1D 真核生物RNA剪切调控a 腺病毒E1A-RNA剪切中外显子缺失腺病毒在宿主细胞内能利用一个基因同时合成三种不一样大小蛋白质，其机理包括到病毒RNA剪切过程中外显子缺失。E1A 基因1234外显子289 aa243 aa 55 aa第44页1D 真核生物RNA剪切调控b SV40病毒大小抗原与剪切多样性关系 SV40病毒基因组含有三个外显子和一个内含子。 在表示小 t 抗原蛋白时，转录物进行正常剪切，只有内含子被切除，E1-E2-E3外显子连成一个成熟mRNA分子，但E2末端含有一个终止密码子，所以在翻译时，只翻译由E1

25、和E2编码小抗原 在表示 T 大抗原蛋白时，内含子和E2外显子均被切除，成熟mRNA中只有E1和E3，但翻译出抗原蛋白分子反而大于 t 抗原。 在不一样动物感染细胞中，存在着不一样百分比t/T抗原蛋白，表出不一样性状。 第45页RNA多样性剪切模式产生SV40 t/T抗原GUAGGU抗原蛋白编码基因t 抗原成熟mRNAt 抗原多肽链GUAGGU抗原蛋白编码基因T 抗原成熟mRNAT 抗原多肽链E1E2E3E1E2E3第46页1D 真核生物RNA剪切调控c 黑腹果蝇性别决定与剪切多样性关系 黑腹果蝇性别决定过程由三个性别特异性RNA剪切程序支配，包括到三个与性别决定相关基因：sxltradsx第

26、47页sxl 基因转录产物多样性剪切造成雌性细胞产生Sxl蛋白 sxl 基因外显子（E3）内含有一个终止密码子，它阻止功效Sxl蛋白质合成。这个外显子在雄性细胞mRNA中存在，但在雌性细胞中，被剪切多样性剔除，其结果是只有雌性细胞产生Sxl蛋白质。Sxl蛋白含有高百分比碱性氨基酸，相同于其它RNA结合蛋白，是 tra基因转录产物多样性剪切调控因子。 第48页tra 基因转录产物多样性剪切造成雌性细胞产生Tra蛋白 tra基因转录产物异样性剪切由Sxl蛋白控制，表示出Tra蛋白又调控tra2基因转录产物异常剪切，形成Tra2蛋白。tra 和tra2两基因tra 基因雄性细胞 无功效蛋白雌性细胞

27、有功效蛋白E1E2E4E3Tra 200 aa产物均含有剪切所必需 Arg-Ser RNA结合区。 第49页dsx 基因转录产物多样性剪切造成细胞产生Dsx两性蛋白 dsx 是一个两性基因，Tra2蛋白促进其正常剪切，表示出雌性发育控制蛋白因子；在Tra2蛋白不存在细胞中，dsx发生异常剪切，表dsx 基因雌性特异性蛋白雄性特异性蛋白E1E5E4E2E3E6达出雄性发育控制蛋白因子。 第50页黑腹果蝇性别决定总程序第51页1E 原核生物反义RNA调控 反义RNA是指能与mRNA、DNA片段、RNA引物互补RNA分子。经过与RNA引物、基因DNA片段、mRNA链互补配对，分别抑制基因复制、转录、

28、翻译过程。原核生物反义RNA由反义基因编码，其本身转录可为蛋白因子开启转录而正调控；亦可由蛋白因子降解反义RNA而负调控。 反义RNA在原核生物中广泛存在，是一个较为普遍基因表示调控方式。当前，依据反义RNA原理设计各类反义核酸，在试验生物学领域已被广泛用于基因表示特异性阻遏剂；在医学药学领域也被用来治疗恶性肿瘤及病毒感染等疾病，即反义技术。第52页1E 原核生物反义RNA调控a 反义RNA抑制DNA复制 直接抑制机理：反义RNA直接与DNA复制起始位点结合，阻 间接抑制机理：反义RNA与RNA引物结合，使之不能与DNA复制模板互补，从而间接影响DNA复制。如大肠杆菌ColE1质粒复碍复制起始

29、蛋白识别与结合，造成DNA复制不能开启。制、金黄色葡萄球pT181质粒复制均采取这种机制。第53页控制复制引物与模板结合oriE.coli ColE1 plasmid复制方向rop（+）RopRNA IIRNA I3553反义RNA间接抑制ColEI质粒复制开启引物型RNA调控型RNA第54页1E 原核生物反义RNA调控b 反义RNA抑制基因转录 反义RNA可与mRNA 5 端互补从而阻止mRNA深入转录。比如：大肠杆菌中 tic RNA（转录抑制互补性RNA）可与cAMP受体蛋白5端mRNA区域互补结合，形成特殊空间结构而使其转录停顿。第55页1E 原核生物反义RNA调控c 反义RNA抑制m

30、RNA翻译 反义RNA主要调控功效表现在翻译水平上。原核生物研究已经确定，反义RNA抑制翻译有以下三种作用方式：与mRNA5端非编码区（5-UTR）结合，妨碍其在核糖体上准确定位；与mRNA5端编码区（主要是起始密码子AUG）结合，抑制翻译起始；与mRNA全编码区结合，抑制其翻译模板功效。第56页大肠杆菌利用反义基大肠杆菌ompC和ompF基因编码外膜蛋白，OmpC使胞内渗透压提升；OmpF使胞内渗透压降低。当环境渗透压增加时，膜蛋白EnvE激活胞内OmpR蛋白，后者诱导ompC和micF两个基因转录。micF转录物是ompF-mRNA反义RNA，它能灭活ompF-mRNA，从而降低胞内Omp

31、F浓度。因调整细胞渗透压UUUUUU CUUUAUCCC-CAUUUGUCUGUAAGUCUUUACUUACUGCAUUAUUUAUUACUGACGGGCAGUGG-CAGGUG-UCAUAAA AUGAGGUAAUAAAUAAUGAUUGACAGAACUUAACACAAAUUAAGCGCCGUGUAAUCGGCGCUUUUCAGAGG：SD序列AAUG：起始密码子EnvZOmpRmicFompFompF mRNAmicF RNA第57页大肠杆菌利用反义基大肠杆菌R1质粒上含有hok和sok基因。hok编码由52个氨基酸组成稳定毒素蛋白，能使细胞膜去极化而杀死细胞。Sok编码hok反义RNA。

32、当细胞分裂时，假如子细胞没有分配到R1质粒，HoK蛋白就会杀死子细因维持质粒稳定性细胞，因为亲本细胞中Sok转录出来反义RNA不稳定而被降解；假如子细胞分配到R1质粒，则Sok基因就能源源不停地为子细胞提供反义RNA，以阻断半衰期较长hok mRNA翻译出HoK毒素蛋白，细胞得以存活。该hok/sok系统确保了细菌品系稳定性第58页1E 原核生物反义RNA调控d 反义技术在试验生物学和医学中应用策略 受反义RNA特异性阻断基因表达原理启发，人们利用生物合成甚至化学合成方法，制备了一系列针对特定病变基因（如癌基因）或病原体基因反义试剂或反义药物，一方面期望经过这些特异性基因表达阻断试剂，体内探查

33、特定基因功能（即所谓loss-of-function战略）；其次也希望能利用这些反义药物对付日趋严重基因分子疾病和病毒感染疾病。第59页由靶基因反向表示体内生成对应反义RNA将靶基因编码序列反向接在转录起始位点下游，转录出来RNA即为靶基因53535353开启子终止子target GENEtarget GENEmRNAantisense RNA会降解RNA。这种战略缺点在于：反义RNA分子量大，轻易引发体内免疫攻击另外，核酸酶也反义RNA。第60页人工设计合成修饰型小分子反义RNA锁核酸 LNA肽核酸 PNA核糖核酸 RNA第61页人工设计合成修饰型小分子反义RNARNASNA第62页反义吗啉

34、寡聚核苷酸 anti-MO oligoRNA靶分子人工设计合成修饰型小分子反义RNA第63页1F 真核生物sRNA介导RNA干扰 RNA分子在遗传信息从DNA到蛋白质传递过程中饰演着主要角色，但几十年来相关RNA消息只能听到微弱声音。近年来一连串发觉表明，一类被称为小分子RNA（small RNAs）物质操纵着很多生命过程。它们能改变基因表示水平甚至关闭基因、编辑基因组、哄骗细胞形成特定组织。所以该领域研究结果被Science杂志连续两年（-）评为年度十大科学成就之一。第64页1F 真核生物sRNA介导RNA干扰a RNA干扰作用发觉 1995年，康奈尔大学Su Guo在用人工合成反义RNA阻

35、断线虫基因表示试验中偶然发觉，反义RNA和正义RNA都能阻断靶基因表示，他对这个结果百思不得其解。直到1998年，美国卡内基研究所Andrew Fire用确凿试验结果证实，在正义RNA阻断基因表示试验中，真正起作用是小分子双链RNA，它们是体外转录正义RNA时生成。上述双链RNA对基因表示阻断作用称为RNA干扰（RNAi）。随即大量研究发觉，RNAi 现象广泛存在于线虫、果蝇、斑马鱼、真菌、植物等生物体内，它们借助于RNAi 抵抗病毒感染，阻断转座子转座作用，以维持其基因组相对稳定性。第65页1F 真核生物sRNA介导RNA干扰a RNA干扰作用发觉RNA干扰与先前所说转录后基因缄默、转基因缄

36、默等术语都是一回事，但常与基因表示反义抑制相混同。反义抑制过程并不包括mRNA催化降解，只是单链反义RNA物理上与mRNA结合并阻断其翻译。Andrew Fire 和 Craig Mello因他们关于线虫RNA干扰研究（1998）而分享诺贝尔生理学或医学奖。第66页b RNA干扰作用机理 外源性双链RNA，不论来自病毒RNA基因组感染还是人工导入，均在细胞质中被Dicer酶裁剪成20-25bp短小双链片段，即 small interfering RNA（siRNA），其3端含有两个凸出碱基，负责siRNA迁移和对靶序列识别。在RISC复合物帮助下，双链siRNA拆成单链，然后再与含有互补序列靶

37、mRNA分子结合，形成局部双链。后者或遭RNase降解，或直接阻断靶mRNA翻译。第67页1F 真核生物sRNA介导RNA干扰c 细胞内固有miRNA 前已述及，siRNA是由体外起源双链RNA经细胞内Dicer酶加工sRNA被命名为：microRNA（miRNA）。 深入探索发觉：在动物、植物、真菌细胞核内，从结构致密异染色质中心粒区域DNA重复序列上会转录出一些特殊RNA前体大分子，它们一样在类似蛋白因子作用下，形成长度为21-23个碱基单链sRNA分子，并发挥特殊生物学功效。这种细胞内编码固有而成。那么细胞内是否也存在着固有RNA类似物呢？第68页miRNA形成首先从异染色质中心粒区域D

38、NA重复序列上转录出大分子非编码型RNA前体（pri-miRNA），后者在核内被微加工器复合物（由RNaseIII组成）先切成大约70个核苷酸茎环结构（pre-miRNA），然后再被运输到细胞质中由Dicer深入裁剪，形成成熟miRNA分子，最终再由几个因子装配而成。第69页Science 319, 1787, miRNA生物功效异染色质装配外成性修饰转录调控转录物剪切调控转录物稳定调控翻译调控结构域组成第70页1F 真核生物sRNA介导RNA干扰d RNA干扰原理应用 如果将外源双链RNA导入细胞中，则双链RNA分子一方面在Dicer作用下裂解成siRNA；其次在以RNA为模板RNA聚合酶R

39、dRP作用下自身扩增，其扩增产物再被Dicer裂解成siRNA。后者解链并与RISC复合物一起作用于靶mRNA上，一方面使其降解，其次又以siRNA作为引物，mRNA为模板，在RdRP催化下合成出mRNA互补链，结果mRNA也变成了双链RNA。它在Dicer作用下也一样被裂解成siRNA。经过这种体内RNA聚合酶链式反应，细胞内siRNA大大增加，显著增加了对基因表达抑制。相关研究结果表明，从21-23个碱基siRNA到几百碱基对双链RNA都能诱发RNA干扰作用，但长双链RNA阻断基因表达效果明显优于短双链RNA。第71页1F 真核生物sRNA介导RNA干扰d RNA干预原理应用上述RNA干扰原理在分子生物学研究领域中用途包含：经过基因表示特异性阻断作用，确定基因功效经过基因表示特异性阻断作用，实施基因治疗然而，怎样将特定双链RNA分子高效导入活细胞、活组织、活