新一代测序技术的原理

1、Next-generation sequencing technology overview第1页Agenda测序技术简史第一代测序技术第二代测序技术第三代测序技术第2页1 测序技术简史19501960197019801990Development of Sanger Sequencing(1977)Invention of Automated FluorescentSequencer(1985)Invention of CapillarySequencer(1996)Invention of Applied BiosystemsSolid System()Invention of Illum

2、ina Genome Analyzer System()Invention of 454 GS 20 Sequencer()chemical degradation method by Maxam-Gilbert method(1977)Chemical degradation method by Whitfield (1954)Invention of Heliscope single molecular sequencerInvention of Single molecule real time(SMRT) DNA sequencingInvention of Nanopore sing

3、le molecular sequencing (Oxford Nanopore corporation)Invention of personal genome machineInvention of optical mappingsystem第3页 1977年，英国人Fred Sanger 发觉，假如在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止DNA链，并能经过电泳按长度分辨。 不一样末端终止DNA链长度是由掺入到新合成链上随机位置ddNTP决定。 由此诞生了以Sanger命名测序原理即双脱氧链终止法测序原理。第4页5磷酸3羟基3,5 -磷酸二酯键核苷酸形成3,5-磷酸二酯键示

4、意图核酸序列形成基础第5页“双脱氧末端终止”含义第6页TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA终止物标识方法因为颜色不一样，4种终止物能够在一起进行反应。第7页第8页第9页3730 xl Sequence Map第10页BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche 454Genome Analyzer/Hiseq ABI SOLiDNext-generation sequencing/Deep sequencing technolog

5、y main platforms第11页454测序原理测序反应以磁珠上大量扩增ssDNA为模板，在每一轮测序反应中，依照T、A、C、G次序依次循环进入，每次只进入一个碱基。假如这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放焦磷酸基团会与反应体系中ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中荧光素分子并发出荧光。经过检测荧光信号释放有没有和强度，确定被测分子序列。光信号由CCD摄像机检测并反应为峰。每个峰高度（光信号）与反应中掺入核苷酸数目成正比。反应结束后，ATP和未掺入dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。第12页454测序流程第13页待

6、测DNA文库构建将基因组DNA/cDNA片段打断至400-800bp，将用于后继扩增测序接头A和一段含有生物素接头B连接到DNA片段上，会产生含有接头AA、AB、BB、BA四种DNA片段，然后与可结合生物素磁珠结合，其中片段AA被洗脱掉，片段ABBABB结合到磁珠上，经过变性处理回收含有接头A和接头B单链DNA。第14页EmulsionPCR将这些ssDNA分别单独与水油包被直径大约28 m磁珠在一起孵育、退火，因为磁珠表面含有与接头互补寡聚核苷酸序列，所以ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以能够确保每一个与磁珠结合小片段都会在各自孵育体系内独立扩增, 扩增产

7、物仍能够结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而到达下一步测序反应所需模板量。第15页测序将携带DNA磁珠与其它反应物混合物，放入PTP板中进行测序。PTP板上含有很多直径约为44 m小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，经过这种方法固定每个磁珠位置以监测接下测序反应。第16页454特点较高测序通量，每个循环能产生总量为400-600 Mb序列。提升测序读长，长度到达400 bp，使得后继序列拼接工作愈加高效、准确。主要缺点是无法准确测量同聚物长度。比如当待测序列中出现Poly(A)情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入

8、T数目只能从荧光信号强度来推测，有可能造成结果不准确。所以454技术主要错误不是来自核苷酸替换，而是来自插入或缺失。第17页BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche 454Genome Analyzer/Hiseq ABI SOLiDNext-generation sequencing/Deep sequencing technology main platforms第18页第19页n=degenerate bases z=universal bases第20页第21页第2

9、2页第23页第24页第25页第26页第27页第28页第29页SOLiD特点通量大成本低序列短Ligase方式即使能一定程度防止phasing/pre-phasing，但增加复杂度也降低了效率灵活性差，对小数据量测序不适用Two-base coding第30页BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche 454Genome Analyzer/Hiseq ABI SOLiDNext-generation sequencing/Deep sequencing technology m

10、ain platforms第31页2 Hiseq （Solexa）测序原理 Solexa是一个基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis，SBS)新型测序方法。经过利用单分子阵列实现在小型芯片(Flow Cell)上进行桥式PCR反应。因为新可逆阻断技术能够实现每次只合成一个碱基，并标识荧光基团，再利用对应激光激发荧光基团，捕捉激发光，从而读取碱基信息。第32页可逆阻断技术第33页CTAGCTA5-3-5GT合成第一个碱基Cycle 1:按次序加入反应试剂去除未反应碱基和试剂激发碱基荧光并搜集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团Cycle 2-n:重复前面步骤GTCTAG

11、TCTGCTAGA基于SBSSolexa测序技术第34页3 Hiseq 测序技术流程 制备芯片模板杂交桥式PCR扩增测序引物准备测序2 测序测序生成 base calls3 数据分析拍照图片IntensitiesReadsAlignments4DNA打断末端修复加A加接头纯化 文库制备1第35页3.1 文库制备 Solexa有三种不一样测序种类：Single-Read Sequencing 单向测序Paired-End Sequencing 双向测序Indexed Sequencing 混合样品测序这三种测序类型文库构建大致一致，主要区分在于接头。第36页Single-Read Sequenc

12、ingFragment DNA535+355+53351.End repair T4 polymerase , DNA Pol 1 (Klenow fragment)35po4po453PhosphorylationT4 polynucleaotide kinase, ATP3.Ligation of adaptors3Apo45A35po42.Add 3 Adenosine with Klenow (3exo- ) and dATP+DNA insert5533SBS oligoP7 反向互补序列3T5po435SBS oligoP7反向互补序列第37页PCR enrichment55335

13、55533331st round PCRP7P5SBS oligoP7 反向互补序列P73第38页PCR enrichment (cont.)5533535353532nd round PCRInsertP7P5SBS oligoP7 反向互补序列P5Cluster templateSBS oligoP7第39页Paired-End Sequencing 双向测序Indexed Sequencing 混合样品测序第40页第41页3.2 芯片制备和测序Cluster 生成步骤:固定扩增线性化 阻断引物杂交Cluster 生成化学步骤cBOT第42页Flow Cell想像图进样孔出样孔第43页Si

14、ngle-Read Sequencing(SR, 单向测序)OHFlow Cell接头diol P7 P5 dioldiol模板杂交dioldiol 延长dioldiol 变性碱基片段杂交固定第44页dioldiol1st cycle 变性1st cycle 退火dioldiol1st cycle 延长dioldioldioldiol2nd cycle 变性2nd cycle 退火dioldioldioldioldioldiol2nd cycle 延长n=35总数碱基片段扩增成簇第45页线性化OH用ddNTP ()阻断Cluster 扩增完成OHdioldiolOHCluster Statio

15、n 结束Primer加测序引物OHNaIO4第46页每一个基因簇就是信号搜集照片上一个亮点第47页YX经过荧光信号读取序列信息第48页123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 经过荧光信号读取序列信息第49页3.3 测序Paired-End Sequencing (PE, 双向测序)和Indexed SequencingSR与PEFlow Cell接头对比 Single ReadPaired End第50页Template Hybridization模板杂交UUOHOH Grafted flowcell芯片上接头U P7 P5 DNA片段杂交和固

16、定 Initial extension 第一链延长UU Denaturation 变性UU第51页1st cycle denaturation 变性n=25total碱基片段扩增成簇UU1st cycle annealing退火UU1st cycle extension延长UU2nd cycle denaturation再变性UU2nd cycle annealing退火UUU2nd cycle extension延长UUU第52页Cluster Station 结束Cluster Amplification扩增后簇UUP5 Linearization(USER)线性化Block with ddNTPs阻断Primer加测序引物第53页Paired End 双向测序SBS进行测序Sequencing First Read第一端测序Denaturation and De-Phosphorylation(PNK)变性与去磷酸化OHOHResynthesis of P5 Str