蛋白质的分离纯化与定性定量分析课件

1、蛋白质的分离纯化与定性定量分析医学分子生物学什么是蛋白质的分离纯化分离：将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。纯化：得到单一蛋白的纯品。为什么要纯化蛋白质？研究特定蛋白质的生物学功能（酶、生物活性蛋白，etc）制备抗体蛋白质晶体学研究研究蛋白质-蛋白质相互作用怎样纯化蛋白质？生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差异，来分离或纯化它。可溶性、等电点、分子大小、生物学性质可溶性：硫酸铵沉淀等电点：离子交换层析分子大小：凝胶过滤层析生物学性质：亲和层析蛋白质纯化的基本设计原则原料应易得到，并尽可能富含目的蛋白；应有特异性的蛋白质检测方法（最重要的因素，决定了纯化能否成功）；分级分离，先粗后细；纯化条

2、件尽量温和，避免蛋白失活。分离纯化的一般程序前处理（取决于采用的材料） 动物材料处理：剔除结缔组织和脂肪组织 种子处理：去种皮，有机溶剂脱脂 动物细胞破碎：匀浆器、超声波处理 植物组织：研磨，纤维素酶 细菌破碎：超声波，溶菌酶如果蛋白质定位于某一细胞器，可用差速离心法将其分离。相对离心力/g时间/min沉降的组分1 0005真核细胞4 00010叶绿体、细胞碎片、细胞核15 00020线粒体、细菌30 00030溶酶体、细菌细胞碎片100 000310 h核糖体粗分级分离（rough fractionation） 获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与其它杂蛋白分离开来。 常用方法：盐析、

3、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等 特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。细分级分离（fine fractionation） 主要方法： 层析：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等 1. 蛋白质的层析分离固定相：固定相是层析的基质。通常是固体（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做

4、液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用；柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。怎样纯化蛋白质？生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差异，来分离或纯化它。可溶性、等电点、分子大小、生物学性质可溶性：硫酸铵沉淀等电点：离子交换层析分子大小：凝胶过滤层析生物学性质：亲和层析1. 离子交换层析离子交换层析利用物质的电荷与层析载体

5、（离子交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离纯化的目的，属于吸附层析。离子交换层析的固定相称为离子交换剂，由基质和基团两部分组成。基质：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二乙烯苯等高分子聚合物；基团：共价结合在基质上的带电基团，可分为正电基团和负电基团。Ion-Exchange chromatographyIf pH mobile phase =7.2 Then charge of the proteins: (-) (-) (+) (+)-+-+Anion exchange column = + chargedIncreased salt concentrationIon-Exchange ch

6、romatography-+-Na+Na+Na+Na+Na+Na+Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-+-Na+Na+Na+基本操作过程样品制备，装柱与平衡上样（样品溶解于A液中）洗脱：穿透峰，洗脱峰收集、鉴定分步洗脱梯度洗脱Size-exclusion chromatographySize-exclusion chromatographyAbsorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also perform an enzyme specific assay.要根据待分离物质的分子量，选择

7、特定的凝胶过滤基质；凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离，也可用于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析”；凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息；凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的15；凝胶过滤的样品浓度越大越好，但一般不要超过100mg/ml。凝胶过滤的注意事项3. 亲和层析以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与抗体，激素与受体，糖与凝集素等。将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之固定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。Affinity chromatographyMakes use of specif

8、ic binding interactions between molecules 1- Incubate crude sample with the immobilized ligand 2- Wash away non bound sample components from solid support 3- Elute Commonly used affinity columns:Ni2+ binds to poly Histines (example 6xHis)Specific antibodies (anti-Flag tag)glutathione binds to GSTPro

9、tein A or G binds antibodiesAffinity chromatographyPossible elution strategies:pHIon strenghDenatureCompetitor ligand or analogAffinity chromatographyNi-NTA columnsThe high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged proteins or peptides is due to:1- the strength with which these ions are held to

10、 the NTA resinNTA has a tetradentate chelating group that occupies four of six sites in the nickel coordination sphere2- the specificity of the interaction between histidine residues and immobilized nickel ions在各种表达载体上都带有各种标签蛋白，如GST-tag、His-tag、V5-tag等，它们不仅可用于鉴定蛋白表达与否，更可用于与之相连的目标蛋白的纯化；通过免疫亲和层析技术，只需一

11、步，即可纯化带有标签的目标蛋白。亲和层析是基因工程中最常用的纯化技术高效与简便：一旦固定化配体制备好后，操作使用非常方便；亲和层析是高度浓缩的过程；可从样品中去除大量杂质；可在活性物质中去除理化性质几乎完全相同的但已失活的那些“杂质”。亲和层析的优点免疫亲和层析：将蛋白质抗体偶联到免疫亲和柱可用于抗原蛋白的纯化；凝集素亲和层析：凝集素是一大类能专一性和糖类和糖复合物结合的蛋白质，固定化凝集素可用于糖蛋白纯化；染料亲和层析：有多种染料可与各种类型的酶结合，又不受酶的作用，可用于多种蛋白的分离。亲和层析中的三大通用技术4. 疏水层析与反向层析蛋白质具有亲水与疏水两重性，如果在层析基质上接上疏水的基

12、团，就能在一定条件下与某些蛋白质的疏水基团相互作用，使之吸附，而达到分离纯化的目的。一般情况下，是高盐吸附（12M 硫酸铵），降低流动相的盐浓度，使样品洗脱。疏水层析的机制与离子交换层析正好相反，因此两者是互补的。反向层析，或称反相色谱，reverse phase chromatography，是液相色谱分析中最常用的技术。当反相色谱用于蛋白质分离时，其原理与疏水层析基本相同，区别在于：疏水层析的配基疏水性较弱（苯基等），所以高盐吸附，低盐洗脱；反相色谱配基疏水性强（C18等），所以需要使用有机溶剂洗脱。反向层析与疏水层析原理相同反相色谱分离蛋白质的原理反相色谱是最高效的蛋白质层析技术之一2.

13、 蛋白质的电泳分离电泳（electrophoresis）带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象称为电泳。蛋白质是两性电解质，在不同pH溶液中带不同电荷，在直流电场中能够泳动。电泳基本原理蛋白质在电场中泳动时，受到两种方向相反的力的作用：电场力 FqE，q为带电量，E为电场强度摩擦力 Fffv，f为摩擦系数，v为迁移速度当蛋白质以恒速运动时，FFf0，即qEfv，此时：v/Eq/fq/6r在一定介质中，蛋白质的q/f是一个定值，因此v/E也是定值，它被称为电泳迁移率，即：v/E可通过实验测定，蛋白质的值为0.110-4 1.010-4 cm2V-1s-1，它是蛋白质的特性之一。电泳的分

14、类自由电泳（移动界面电泳）区带电泳：在支持物上，蛋白质混合物被分离成若干区带。稳态电泳：蛋白质迁移一段时间后达到稳态，带的宽度不再随时间而改变。1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（bis）经共聚合而成，此过程在TEMED和过硫酸铵催化下进行。Acr在AP和TEMED的作用下形成单链，随后通过bis的作用交叉互联形成网状结构，聚合成凝胶。凝胶的孔径可在较宽范围内变化，以迎合不同的分离需要。根据凝胶的均匀性（孔径、pH）可分为连续与不连续两类；根据是否加蛋白质变性剂，可分为变性与非变性两类；根据是否加还原剂2-巯基乙醇或DTT，可分为还原与非还原两类；还可根据电泳装置

15、的不同，分为圆盘电泳和平板电泳。PAGE的分类平板PAGE不连续平板PAGE，是使用 最广泛的蛋白质电泳技术，它由浓缩胶与分离胶两部分组成。不连续PAGE有很高的分辨力，因为它有以下三种效应：浓缩效应电荷效应分子筛效应不连续PAGE制备凝胶样品电泳目的蛋白检测基本操作染色法：考马斯亮蓝染色法（多种类型可选）、银染法；活性检测法：适用于Native PAGE，其中蛋白质保持天然活性，可用酶学方法检测；免疫印迹法：用特异性抗体检测蛋白质的技术。PAGE的检测方法多种多样2. 等电聚焦电泳根据蛋白质的等电点进行分离的一种技术。基本原理：利用两性电解质载体形成一个连续而稳定的线性pH梯度，使pH从正极

16、到负极逐渐增加。蛋白质分子在偏离其等电点的pH位置带电，因此在电场中可以移动；当蛋白质移动到pH等于pI位点，其静电荷为0，在电场中不再移动，据此可将不同pI的蛋白质分离。优点样品加样位置和体积不受限制；分辨率高于其它类型电泳；可测定pI值；缺点样品在pI区域易沉淀，为增加样品溶解度，可以在胶中加入尿素，但导致蛋白质失活；样品前处理麻烦。等电聚焦的优缺点3. 双向电泳将等电聚焦技术与SDS技术组合起来的新技术，是目前分离蛋白质混合物最强大的技术，也是蛋白质组学研究的重要技术。基本步骤：第一相等电聚焦后，在等电聚焦的垂直的方向进行第二相SDS。pH 3 - - - - - - 10（1） IEF

17、等电聚焦电泳（2）SDS（3）染色脱色考马斯亮蓝银 染可综合利用层析和电泳分离纯化蛋白质蛋白质的浓缩超滤法使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤的技术。常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在膜内。冷冻干燥法在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的技术，保持蛋白质构象的最好方法。注意：必须保证蛋白质始终处于冷冻状态（在70冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂（右旋糖酐、甘露醇等）。吸收法采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。PEG、蔗糖、凝胶干粉等。沉淀法硫酸铵、PEG、有机溶剂沉淀；免疫沉淀。3. 蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的总蛋白含量；

18、目前没有任何方法能直接分析样品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考马斯亮蓝）、BCA法、紫外分光光度法等。1. Lowry法1951年Lowry在Folin酚试剂法和双缩脲法的基础上建立原理：第一步反应：在碱性溶液中蛋白与Cu2+反应形成紫红色的络合物； 第二步反应：酚试剂（磷钼酸和磷钨酸混合液）与蛋白质芳香族氨基酸反应呈深蓝色。优点：同时分析多个样品，简便；灵敏度提高；避免酚试剂局限于色氨酸和酪氨酸所造成的蛋白质含量测定偏差。缺点：要求溶液完全溶解透明；酚试剂在碱性溶液中稳定性差，导致测定误差；反应受多种物质干扰。2. Bradford法由Brad

19、ford等人于1976年建立。基本原理：考马斯亮蓝G-250在一定条件下可与蛋白质结合，导致其颜色从红色变为蓝色，最大光吸收峰从465nm移至595nm，其吸收度与蛋白质浓度成正比。目前绝大多数公司都提供基于此原理的蛋白质定量试剂盒。优缺点优点：操作简便，配合酶标仪，可同时测定多个样品；可测定低达25 g/ml的蛋白质样品；对干扰剂不敏感；缺点：染料主要结合蛋白质的疏水区，因此不同组成的蛋白质与染料的结合比例不同。3. BCA法原理：第一步，在碱性溶液中，蛋白质与Cu2+反应形成复合物；第二步，BCA试剂与该复合物反应，生成深紫色化合物，在562nm处有吸收峰。优点：操作简便，线性范围2020

20、00 g/ml；有试剂盒出售。4. 紫外分光光度法原理：蛋白质中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽键在215nm附近有特异吸收。可通过测定该波长的光吸收度，计算蛋白质浓度。CA/KL，其中A为吸光度，K为摩尔消光系数，L为光程。K值可通过各种方法得到（包括软件分析等）。优缺点优点：操作简便，且敏感度高（20 g/ml ）；样品不损失，测定后可继续使用。缺点：核酸可干扰测定结果；不同蛋白质芳香族氨基酸含量变动较大。5. 凯氏定氮法1883年，丹麦化学家Kjeldahl建立，基于蛋白质的含氮量在16%左右。蛋白质+硫酸CO2+H2O+NH3硫酸铵+强碱氨优点：适用样品广泛，结果可靠缺点：

21、样品中非蛋白态氨影响测定值；蛋白质氨基酸有偏差时（大量碱性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）误差较大；操作繁琐。4. 蛋白质分子量的测定1. SDS测定分子量基本原理：SDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键，并按一定比例（1g蛋白质结合1.4g SDS）和蛋白质组成复合物，使蛋白质带的负电荷的量远远超过其本身的电荷量，并与蛋白质的分子量成正比。2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒形，其轴长与分子量成正比。q/fq/6r，所有蛋白质的迁移率都相同。在SDS中迁移的蛋白质的分子量与电泳迁移率的关系符合下述公式：lg MrlgKbmK1bm其中Mr为蛋白质相对分子量，K、K1为常数，b为斜率，

22、m为迁移率。注意：此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移在半对数坐标纸上做出标准曲线注意：标准曲线的斜率会根据所用凝胶浓度而发生微小的改变。2. 凝胶过滤层析法测定分子量蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示：lg MrK1K2 Ve在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lg Mr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。SDS与凝胶过滤法是互补的凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量；SDS测得的是蛋白质亚基的分子量；在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS可测得蛋白质每条多肽链的分子量。综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。例如： 凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：180kD SDS（不加还原剂）结果：45kD SDS（加还原剂）结果：两条蛋白带（15kD和30kD）则结论是： 该蛋白质由4个相同的亚基组成，每个亚基由两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链的分子量分别为15kD和30kD。质谱法是最精确的分子量测定方法质谱（ Mass Spectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎