血清白蛋白的分离与纯化、蛋白定量测定课件

1、血清白蛋白的分离与纯化、蛋白定量测定实验目的掌握DEAE纤维素层析法分离纯化蛋白的方法掌握考马斯亮兰法测定蛋白质的原理DEAE纤维素层析法分离纯化白蛋白离子交换层析基本原理根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式离子交换剂 离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）和反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如纤维素，交联葡聚糖，交联琼脂糖等；树脂 O N+(CH3)2 OH-纤维素O CH2 COO- Na基质 电荷基团 反离子 阳离子交换剂阴离子交换剂离子交换纯化原理 如果要分离纯

2、化一种具有兼性离子特性的生物大分子，其离子化的程度取决于它所在溶液中的净电荷。生物分子带电荷与否，或带什么样的电荷，主要决定于溶液的pH值。溶液的pHpI，生物大分子带负电荷，解离成负离子溶液的pHpI，生物大分子带正电荷，解离成正离子+H+H+RCHCOOH|NH3+RCHCOO-|NH3+RCHCOO-|NH2-H+-H+pHpI人血清蛋白质的等电点及分子量 蛋白质等电点分子量白蛋白4.88690001-球蛋白5.062000002-球蛋白5.06300000-球蛋白5.12 9000-150000-球蛋白6.85-7.50156000-300000实验步骤装柱：取一根1cm2cm的层析柱

3、垂直夹在铁架上，注入1cm高的0.02mol/L pH6.5NH4Ac缓冲液。将已处理浸泡在0.02mol/L pH6.5NH4Ac缓冲液中的DEAE纤维素搅成悬浮状(沉淀的纤维素与NH4Ac溶液体积比为1:2)，加入层析柱内，慢慢打开底部出口，同时不断加入DEAE纤维素直至柱高10cm。平衡：纤维素柱床上留有3cm高的溶液，将层析柱两头旋紧，接上恒流泵，用0.02mol/L pH6.5NH4Ac缓冲液平衡20min(流速为1ml/min,层析柱两头要旋紧，防止柱床流干)洗脱：平衡完成后，旋下上塞，慢慢打开底口使纤维素床上的液面下降到与床面相齐，夹住底口。将样品加到纤维素柱上，打开底口使样品进

4、入到床体，直到与床面相齐，吸1.0ml 0.02mol/L pH6.5NH4Ac溶液，沿柱壁慢慢加入纤维素床面上(三次，操作同上)，洗净沾在柱壁上的蛋白液。在纤维素床面上加3cm高的0.02mol/L pH6.5NH4Ac溶液，将层析柱两头柱塞旋紧，接上恒流泵，用0.060.5mol/L pH6.5NH4Ac溶液进行梯度洗脱(流速为1ml/min)。室加入0.06mol/L pH6.5NH4Ac溶液200ml，室加入0.5mol/L pH6.5NH4Ac溶液200ml。考马斯亮兰法测定蛋白质实验步骤1、标准方法(1)具体测定按下表操作(待测样品的加样量见下表的第8、9、10管)加入物(ml)12*23*24*25*26*27*28*29*210*2标准蛋白00.010.020.040.060.080.10-待测蛋白-0.020.040.06蒸馏水0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04考马斯亮蓝试剂5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0边加边混匀，2-3分钟后，以1号管为空白对照，测定各样品在595nm处的光吸收值A595注意事项：最好在试剂加入后的5-20min内测定吸光值，因为这段时间内颜色最稳定测