DNA的体外重组与转移课件

1、第六章 DNA的体外重组与转移 外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞重组DNA分子的构建需要考虑三个因素 （1）实验步骤要尽可能地简单易行； （2）连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段； （3）外源基因必须在表达载体的启动子下，并置于正确的ORF中，以便目的基因的表达。第一节 重组DNA分子的构建一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。优点：实验操作简单，易于回收外源DNA片段缺点： （1）不易定向克隆 （2） 难插入特定的基因 （3）大片段DNA的重

2、组率低 （4）载体易发生自身串联 （5）目的片段自身各拷贝之间可能自连1、一种限制性核酸内切酶酶切的粘性末端间的连接碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化 用识别序列完全不同的一对限制性酶同时消化一个特定的DNA分子，将会产生具有两个不同粘性末端的DNA片段，并可使该片段按一定方向插入到载体分子上，当然载体分子需用同一对限制性内切酶处理。2、不同限制性核酸内切酶酶切的粘性末端的连接 另外，可应用同尾酶（识别序列不同，但末端相同）连接。连接后，形成的重组子不被原来的酶识别切割，但有时可被第三种酶的识别切割。同尾酶的连接 对于两个不能互补的粘性末端的连接，通常采用平头末端的连接方式，

3、即先将其处理成平头末端，再连接，具有两种情况。 （1）5突出末端的补平：大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段； （ 2）3突出末端的切平：T4噬菌体DNA聚合酶或S1核酸酶。 平头末端连接的缺点：连接效率低、破坏原有的识别序列、双向插入及多拷贝插入。二、平头末端的连接1、直接连接 T4 DNA连接酶虽然能直接连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。55553333-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-53-OH-PP-HO-53缺点：优点：不易自身环化、连接效率高、所有DNA片段均可用此法。非酶切位点操作繁锁、外源片段难以回收、有可能影响外源基因的表达。 用T4 DNA连接酶连到平端

4、DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（1）衔接物（linker）连接 linker 用化学合成法合成的一段8-12bp的含有特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRI linker： linker的作用3、人工接头法缺点：a、可以用内切酶把插入片段切下来。 如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段，需进行甲基化保护及去保护，该操作较繁琐。b、能给载体连接上Polylinker:优点：（2）DNA接头 (adapter)连接法1978年康奈尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5BamHI adapter

5、用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。 adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 adapter的作用 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。优点：连上后就能用。缺点： 先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。 接头连接在载体上以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。防止自我连接三、PCR产物的连接1、在引物的5端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3端1520bp与模板互补；5端610bp是某个内切酶的识别序列。避免与所扩增的DNA片段内部酶切位点重复。引

6、物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5-3GCAGAATTC互补序列5-33模板GCAGAATTC互补序列 PCR产物5-33复性延伸模板模板33带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5-3CCTAGGCGGPCR产物-53-CGTCTTAAGGGATCCGCCEcoRI位点BamHI位点AATTCPCR产物5-3CCTAGPCR产物-53-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！2、与T载体直接连接（1）PCR产物两个3端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3端人为地各加一个T 利用

7、末端脱氧核苷酸转移酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！四、DNA体外连接应注意的事项1、插入片段与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。2、DNA插入的方向正确用双酶切 由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3、插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码子 尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATG CGA ATTC载体GGAGAATTC ATG CAG插入片段EcoRIEcoRIATG CGA ATT CAT GCA G重组但移码突变！4、防止载体

8、自身环化连接（1）提高插入片段的用量连接反应体系中，插入片段比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片段以单链连接。53载体插入片段（3）用同聚物加尾法处理载体2. 载体自身环化连接（能存活）3. 载体之间互相连接（能存活）4. 插入片段互相连接（不能存活）5. 一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA插入片段的连接结果6. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）1. 一个载体与一个插入片段重组（能存活） 受体细胞：能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞。 根据细胞的种类可分为三类： * 原核生

9、物受体细胞 * 植物受体细胞 * 动物受体细胞第二节 重组体导入受体细胞1、原核生物受体细胞特点： 1）染色体裸露，便于外源DNA重组 2）基因组简单，便于进行遗传分析 3）单细胞生物，易于获得一致性受体细胞 4）培养条件简单，生长快，实验周期短主要的原核受体细胞： 大肠杆菌，枯草杆菌，蓝细菌等应用 * 保存和扩增目的基因 * 表达基因产物 * 构建基因组文库2、植物受体细胞特点： 1）具有体细胞全能性，一个分离的活细胞 在合适的条件下可分化成植株 2）具有坚硬的细胞壁，可以纤维素酶处理 获得原生质体.应用： 转基因棉花，水稻，玉米，马铃薯，烟草3、动物受体细胞特点 1）体细胞一般无全能性，只

10、能分化到细胞株 2）生殖细胞、胚胎细胞等具有全能性，可分 化、培养成转基因动物应用 转基因羊，鼠，兔，猪，牛，检测动物核酸疫苗的表达等。一、重组体导入原核细胞（一）感受态大肠杆菌的制备处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞。2、目的增加受体菌细胞膜的通透性。1、概念使用丧失了限制体系的大肠杆菌。3、菌种（以E.coli为例） 在0 的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，增加细胞膜的通透性。 转化时加入DNA后， Ca2+ 能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶的羟基磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间

11、隙，即可使外源DNA进入细胞内。4、制备原理5、制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4冰上 5-10 min4离心收集菌用冰冷的（50-100） mMCaCl2重悬4离心收集菌4离心收集菌分装、-70 冻存用冰冷的（50-100）mMCaCl2重悬On ice 30 min用冰冷的60mMCaCl2重悬（二）重组DNA导入原核细胞的方法1、转化（transformation)（1）化学转化（2）电转化 DNA分子通过与细胞膜结合进入受体细胞并在细胞内稳定维持和表达的过程10ng重组DNA100L感受态菌冰上静置30分钟42C 4590秒加入1mL LB培养基37摇45分1.5小时10-

12、100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）化学转化（热休克法）冰上静置23分钟简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。基本原理： 在一定强度脉冲电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生暂时性缝隙或微孔，质粒或DNA重组分子便可由此微孔进入细胞实现外源基因的转移。特点： 转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法利用扫描电镜拍摄的电穿孔照片电穿孔仪LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，4离心集菌冰冷的水重悬菌体4离心集菌冰冷的水重悬菌体4离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪0.5g质粒DNAOn ice混合加入1mLSOC培养液37

13、 中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化操作方法定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中有108个分子能进入受体细胞。如果一微克pUC18共有31011个分子，也就是说，每3000个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞（108/31011）。（3）转化率 转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模。 例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/g载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得10

14、4个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 /（107 100） = 0.1 g 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5g 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算出（5g）。 重组质粒 影响转化率的因素载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的空载体超螺旋质粒低两个数量级。插入片段的大小：对质粒载体而言，插入

15、片段越大，转化效率越低。a、生长状态制备感受态时菌体OD值要控制在0.30.4。b、必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。d、储存感受态细胞要在-70以下c、CaCl2处理e、使用感受态菌时必须在冰上融化融化后一般不能再次冻存使用。 感受态细胞 （competent cells） 把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。体外包装（in vitro packaging） 感受态细胞的培养 液体培养基中培养至OD600 = 0.5左右 重组DNA通过噬菌体蛋白或病毒蛋白包装成有感染能力的噬菌体或病毒颗粒而进入宿主细胞的方式。2、转导（tran

16、sduction) 加入新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选吸附 加入经体外包装好的重组噬菌体悬液，30保温10分钟转导裂解（1）扩增操作： 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37培养45min1.5h，噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作。（2）扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定3、转化细胞的扩增 主要是以动植物病毒、反转录病毒及植物农杆菌Ti质粒直接转染或转化受

17、体细胞，把外源DNA引入。优点：定向性好、效率高、重复性好缺点：载体的侵染范围有限二、外源基因导入真核细胞1、借助于载体的基因转移（1）基本原理 将转移的DNA溶液与适量CaCl2的溶液混合，再加入一定量的磷酸盐溶液，逐步生成DNA磷酸钙沉淀复合物。将适量的该复合物加入细胞培养液中，通过细胞的胞饮作用进入细胞质或进而转移到细胞核内，然后整合到染色体上，或游离于细胞质中逐渐降解。（2）操作步骤： DNA磷酸钙沉淀复合物的制备 沉淀复合物向受体细胞的转移 后培养2、磷酸钙共沉淀3、脂质体（lipofectin）介导法 通过脂质体与DNA静电结合或直接将DNA包裹，并透过细胞膜把DNA运送到细胞内，

18、实现外源基因的有效转染。脂质体有商业试剂盒。 二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4、DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖葡聚糖+DNA 吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。（1）原生质体融合法 用酶去除微生物和植物细胞的细胞壁，形成原生质体，将外源基因与原生质体混合，在PEG（聚乙二醇）作用下使外源基因导入细胞。5、其他导入方法（2）电穿孔法 利用外加电场，击穿受体细胞的细胞壁和细胞膜，使重组DNA进入原生质体，通过筛选、诱导分化获得转基因植株。* 要求细胞膜的破坏不会造成对细胞的致命伤害（3）基因枪法 利用被放电或机械加速的金属微粒轰击受体细胞，使吸附在金属微粒表面的重组DNA一起进入受体细胞。 （4）激光微束穿孔法