微生物检验手册(中文)

1、微生物检验手册微生物检验手册中国食品安全中心中国食品安全中心菌落总数菌落总数1、试验材料电子天平电子天平, 药匙, (500定夹, 均质机,移液枪,吸管(10), 高压灭菌锅, 生化培育箱(35 ), 灭菌均质袋, 固,25,1), 一次性平板 (直径910 cm,高度1.5 cm), 菌落计数器, 酒精,灭菌试管(18 x 170mm), 试管振荡器。2、试剂氯化钠氯化钠(Sigma)3次超纯水3、试剂配制方法NaCl 2.125 g3次超纯水250，121 NaCl 2.125 g3次超纯水250，121 15分钟灭菌。Plate Count Agar(DIFCO) 2.35 g3次超纯水

2、100Plate Count Agar(DIFCO) 2.35 g3次超纯水100，121 15分钟灭菌。(3) 0.85% NaCl (100 )NaClNaCl 0.85 g3次超纯水100121 15分钟灭菌。,搅拌均匀溶解后, 分装到试管中9t e，全部微生物试验中，除均质在无菌室进展，其余的操作都要在超净工作台内。4、 试验步骤全部微生物试验中，除均质在无菌室进展，其余的操作都要在超净工作台内。无菌操作取25g或25ml样品，参加 225灭菌生理盐水；均质2分钟。取 1样液参加到9生理盐水试管中。依次做10倍梯度稀释。从适宜的梯度中1加到无菌平板中2个平板，参加0平板计数琼脂，混匀方

3、向：冷凝后放到351培育箱中培育2448h。菌落计数 菌落总数试验方法称量样品称量样品25g +0.85% NaCl 225-stomaching 2min取取均质后的1溶液参加到9灭菌生理盐水试管中，vortexing dilution从从适宜的稀释度取1加到平板中，每个稀释度做2个平板倒45左右PCA(plate count agar)，15-20ml/平板待平板凝固后培育：351 48h菌落计数counting菌落计数 (全部菌落定量试验都实行这种方法)韩国方法中要求每个平板中30300内的计数参照GB/T 4789.2-2022 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定大肠菌群大肠菌群定性试

4、验：试验材料电子天平电子天平,锥形瓶(500), 高压灭菌锅,生化培育箱(35 ),均质器,试管，移液, 1),无菌平板(直径910 cm,高1.5 cm), 磁力搅拌器、搅拌棒，试管振荡器，载玻片、盖玻片，酒精试剂NaClNaClBrilliant Green Lactose Broth (DIFCO)EMB Agar (DIFCO)养分琼脂 (DIFCO)3次超纯水(MERCK)试剂配制方法NaCl 2.125 g3次超纯水250，121NaCl 2.125 g3次超纯水250，121 15分钟灭菌。Brilliant Green Lactose Broth4g到100ml3Brillia

5、nt Green Lactose Broth4g到100ml31/管15分钟灭菌。EMB Agar (DIFCO) (100 )EMBEMB Agar 3.6g3次超纯水100ml/，121 15分钟灭菌，冷却至45倒平板，15-20Nutrient Agar (DIFCO)2.3 g3次超纯水100Nutrient Agar (DIFCO)2.3 g3次超纯水100倒平板，15-20ml/皿 。，121 15分钟灭菌，冷却至45试验步骤无菌操作取25 g样品，参加225ml 灭菌生理盐水,均质 2分钟。取1ml 样液加到 10ml BGLB (2 管，带小导管) 中。1110BGLB把试管放

6、到351 中培育 2448h；取产酸产气的试管在 EMB 平板上划线。把EMB351 242h。挑取有金属光泽的菌落划线到养分琼脂上, 351 培育 24h。将菌落革兰氏染色并镜检；用API 20E 做生化鉴定。无菌操作取 25 g无菌操作取 25 g样品，参加225ml 灭菌生理盐水,均质 2分钟取取1ml 样液加到 10ml BGLB (2 管，带小导管) 中 取取产气的试管在 EMB 平板上划线 确确认是否有金属光泽、粘稠的绿色菌落大肠菌群在EMB上特征挑取可疑菌落挑取可疑菌落划线到养分琼脂上 ,h将将菌落革兰氏染色并镜检；用API 20E 做生化鉴定定量试验 3M 方法测大肠菌群总数取

7、样品取样品25g + 0.85% NaCl 225ml均质2分钟取1ml取1ml 样液加到9ml 0.85% NaCl 梯度稀释选适宜的梯度取选适宜的梯度取1ml样液加到 3Mpetrifilmcoliformcountplate做2351,培育244小时菌落计数菌落计数蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌 s )分析方法API 50CHBAPI 50CHB Kit (社磷酸缓冲液)MYP(Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin) agar (Difco 社)50 % Egg Yolk (Difco 社) PolymyxinBSulfate(Sigma 社)Nutrient agar (D

8、ifco 社)培育基配制方法磷酸缓冲液 (800配制)33次蒸馏水到 800灭菌后 灭菌的磷酸缓冲液 1稀释.灭菌磷酸缓冲液KH PO34g里添加3次蒸馏水 50024溶解后 添加1N NaOH 175调整 pH 到7.23 次蒸馏水到 1000后灭菌.Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin agar (1L 配制)BeefBeef ExtractPeptone Mannitol SodiumChloridePhenol Red Agar3次 蒸馏水1g10g10g10g0.025g (1015g900conc2.5mg/ 混合摇匀后灭菌.灭菌后的 MYP agar 45, P

9、olymyxin B 100,000 unit (25,000unit/stock 4固后使用) 50% 软黄液 50ml 混合摇匀,灭菌 Petri-Dish 分注,凝PolymyxinBstock配制方法(200配制)PolymyxinPolymyxin B Sulfate (Sigma, 5,000,000 unit霉菌蒸馏水 200里溶解 调25,000unit/的 浓度 0.45filter 来过滤冷藏保管.试验法- 定性分析法样品 样品 25g + 灭菌的磷酸缓冲溶液 225ml 混合stomaching 2 分钟均质后的样品取 均质后的样品取 1 针MYP agar 里 stre

10、aking30, 24 小时培育带浑浊的环的粉红色菌落带浑浊的环的粉红色菌落(Mannitol分解)选择不确定的状况 24 小时 再培育后观看取取1针 Nutrient agar 里 streaking30, 24 小时培育GramGramstaining 结果阳性, 杆菌, 孢子形成的话API 50 CHB kitVITEK 来观看定量分析法样品 样品 25g + 灭菌 磷酸缓冲稀释溶液 225ml 混合stomaching 2 分钟灭菌的 灭菌的 9灭菌磷酸缓冲稀释溶液试剂混合液 各 1 均质后的样品各 均质后的样品各 0.2ml 提取MYP agar 5 spreading30, 24 小时培育colony colony选择 (带浑浊环的粉红色菌落) counting不确定的 不确定的 colony 中 5个 以上 取一针