电子科大细胞生物学第三章 细胞生物学研究方法课件

1、第三章 细胞生物学研究方法 概要了解细胞生物学常用研究方法，包括细胞形态结构观察方法、细胞组分分析方法、细胞培养方法、细胞工程与显微操作技术等。本章学习要求细胞形态结构观察方法细胞组分分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术本章主要教学内容第一节 细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术（light microscopy) 肉眼的分辨率：0.2mm； 光镜分辨率： 0.2um； EM分辨率可达到0.2nm1m=103mm=106um=109nm2、荧光显微镜技术原理与应用 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 应用：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位。（Fluorescence

2、Microscopy）（Laser Scanning Confocal Microscopy）物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点，彼此互相共聚焦。激光束（光源）经双色镜反射后，通过物镜汇聚到样品某一焦点。从焦点发射的荧光（样3、激光共焦扫描显微镜技术 原理品一般经免疫荧光标记）经透镜汇聚成像，被检测器检出。通过样品其他部位的激光即激光发出的荧光不会聚焦成像，因而检测器不能检出。排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7倍)，可重构样品的三维结构。 应用：4、荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance enerrgy transfer, FRET） 用于检

3、测活细胞中两个蛋白质分子之间的直接相互作用。 供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，且两个探针距离在10nm范围以内时，会发生一种非放射性的能量转移，产生FRET现象。 可选择供体蛋白CFP和受体蛋白YFP分别与两种目的蛋白融合表达。当这两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，供体CFP发出的荧光可被YFP所吸收，并激发YFP发出黄色荧光。此时可通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光越少。反之，不会产生FRET效应。5、荧光漂白恢复技术（fluorescence recovery

4、 after photobleaching, FRAP） 该技术起源于20世纪70年代。使用与蛋白质或脂质耦联的亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等，检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。 是研究膜蛋白或膜脂流动性的基本实验技术之一。 荧光素标记膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射细胞表面某一区域，使被照射区的荧光淬灭变暗。由于膜的流动性，淬灭区域的亮度逐渐增加，最后恢复到与周围的荧光强度相等。根据荧光恢复的速度可推算出膜蛋白或膜脂扩散速度。 抗鼠细胞膜蛋白的荧光抗体（显绿色荧光）和抗人红细胞蛋白的荧光抗体（显红色荧光）分别标记小鼠和人的细胞表面，然

5、后用灭活的仙台病毒处理使两种细胞融合。10min后不同颜色的荧光在融合细胞表面开始扩散，40min后已分辨不出融合细胞表面绿色荧光或红色荧光区域。证明膜蛋白的流动性二、 电子显微镜技术 透射电镜（TEM）1) 超薄切片技术2) 负染色技术3) 冰冻蚀刻技术4) 真空喷镀技术5) 电镜三维重构技术 扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM） 透射电镜的基本构造 透射电镜主要制样技术（1）透射电镜基本构造1、透射电镜 （TEM） 显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LM200nm可见光玻璃透镜不要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化100nm紫外光玻璃透镜

6、不要求真空TEM0.1nm电子束电磁透镜要求真空（1.33x10-51.33x10-3Pa）利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差 （2）电镜与光镜的比较 戊二醛：是一种化学交联剂，渗透速率较四氧化锇快，能固定蛋白和糖类（特别是糖原）。一般用戊二醛进行前固定。但对大多数脂类的固定作用不强，样品仅用戊二醛固定后，其反差不好，最好再用四氧化锇进行后固定。常用的固定剂：醛类固定剂、四氧化锇等单一固定剂不能固定细胞内所有组分，常需联合使用不同固定剂。常采用戊二醛和四氧化锇双重固定。 四氧化锇：是一种重金属化合物，能与不饱和脂肪酸反应，是膜结构最佳固定剂。四氧化锇在随后的脱水过程中可被还原形成锇黑，使样

7、品反差增强。但四氧化锇渗透缓慢，对酶活性和抗原活性破坏较大。取材与固定超薄切片一般收集在金属载网上进行观察。常用铜网为200400目，此外根据不同的实验要求还可选用金网、镍网等。载网上一般包被一层支持膜，以支撑载网上的超薄切片，增加其稳定性。最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲醛)、火棉胶、碳等。包埋好的组织块需在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀切成超薄切片。切片生物样品多数是由碳、氢、氧、氮等元素组成的，这些元素的原子序数低，散射电子的能力不强，在电镜下的反差非常弱，因此通常需用高分子量的金属盐来对超薄切片进行染色，由于细胞的不同结构对金属盐的亲和力不同，因此染色后不同结构对电子的散射能力亦

8、不同，从而增强了细胞结构的反差。常用染色液:醋酸双氧铀和铅染液电镜观察染色与观察大鼠骨髓干细胞的超薄切片（引自G.M.Wright et al） 染色背景，衬托出样品的精细结构。Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens.Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).2）负染色技术常用染色剂

9、：2磷钨酸水溶液（Negative staining）家蚕细小病毒负染色电镜照片(病毒直径20nm)（陈立华、翟中和） 制备过程简单，只需将样品制成悬液，直接滴于载网上，然后用重金属物质染液染色。即可在EM下观察。重金属物质散射电子的能力较样品本身强，电镜下两者显示出明显的明暗对比，样品呈亮色，而其周围的背景将呈暗色，这样样品表面的微细结构就被衬托出来。常用染色剂：2磷钨酸水溶液 真空喷镀一般在喷镀仪中进行，将铂、铬、金等重金属在高真空条件下加热，使其蒸发，蒸发出来的金属粒子以一定的角度斜向喷镀于样品表面，这样凸出的样品表面将比周围背景优先包被一层金属薄膜，二者之间的反差加大，样品轮廓清晰地显

10、示出来。 单方向喷镀，样品向着金属发射源一面沉积金属粒子较多，而背侧面较少，形成投影。增强样品反差，样品富立体感。 旋转喷镀，可使样品表面的金属薄膜均匀一致。3）真空喷镀技术a）快速冷冻b）低温断裂c）蚀刻d）复型主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。4）冰冻蚀刻技术（Freeze etching）样品在低温下迅速冷冻（液氮或液氦中）和低温下，结构“脆弱”部位（膜脂双分子层疏水端）断裂，显示出膜脂中的蛋白质颗粒，真空中冰升华，进一步增强“浮雕”式蚀刻效果，铂金喷镀形成凹凸电子反差，真空喷镀碳膜，样品再经消化液消化，收集复型膜在电镜下观察。2、扫描电镜（SEM）CO 2临界点干燥法防止主

11、要观察样品表面的形貌特征。 应用原理温度以上使CO2以气态形式逸去。 引起样品变形的表面张力问题。常用液态CO2浸透样品，然后在临界成像立体感强，一般扫描电镜分辨率为3nm。近年来研制的低压高分辨扫描电镜其分辨率可达0.7nm，可用于观察核孔复合体等更精细结构。疟疾破坏的两个红细胞Scanning Tunneling Microscope, STM80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等。扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品

12、表面形貌信息、电特性或磁特性等。原理 装置扫描的压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。三、扫描遂道显微镜1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高（侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.01nm）。2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息。3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。4）可连续成像，进行动态观察。特点纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。 用途 离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技

13、术第二节 细胞组分的分析方法一、 离心分离技术用于分离细胞器与生物大分子及其复合物。 破碎细胞：低渗匀浆、超声波破碎、研磨等。 差速离心：利用不同离心速度分离密度不同的细胞组分。 密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离。 用途 基本操作过程二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法 利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特性，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。 原理显示DNA分布福尔根染色（Feulgen Stain）酸水解可除去RNA，仅保留DNA，并除去DNA上的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露的自由醛基与schiff试剂反

14、应呈紫红色。PAS反应可确定多糖存在。原理是利用schiff试剂与醛基之间的反应，但其醛基来自碘酸氧化多糖的1、2-乙二醇基。四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂肪滴存在。糖类显色反应脂类显色反应氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应呈红色。检测方法有多种氢氧化重氮与酪氨酸、色氨酸和组氨酸，形成有色复合物。可用硫醇盐共价键的试剂进行检测。如检测碱性磷酸酶可用格莫瑞（Gomori）方法。蛋白质显色反应米伦（Millon）反应重氮反应蛋白质-SH检测酶检测三、特异蛋白抗原的定位与定性快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白

15、的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。免疫荧光技术免疫电镜技术四、细胞内特异核酸的定位与定性光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） PCR技术五、放射自显影技术原理：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究。应用：实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 步骤：前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）； 放射自显影。鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞24小时后，用3H尿嘧啶核苷脉冲标记10分钟的电镜放射自显影图片。在病毒大量复制与装

16、配的宿主细胞中，核仁（Nu）依然存在，并保持其转录功能 SG： 银颗粒； N： 细胞核； Nu： 核仁； C： 细胞质。 六、定量细胞化学分析技术 细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法流式细胞仪（Flow Cytometry） 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。主要应用： 细胞的培养 细胞工程

17、第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞的培养 类型： 原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） 细胞株（cell strain）: 正常二倍体，接触抑制（是指细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象） 细胞系（cell line）： 亚二倍体，接触抑制丧失动物细胞培养 首先从健康动物取出组织块，剪碎，用胰酶或胶原酶与EDTA（螯合剂）等将细胞连接处消化分散，给予良好的营养液与无菌的培养环境（接近体温与体内pH）, 在培养瓶中进行静止或慢速转动培养。不论用何种培养液，一般都要加一定量的小牛血清，这样才有利于细胞的贴壁

18、生长与分裂。 动物原代细胞培养步骤原代细胞（primary cell）传代细胞（sub-culture cell） 将肌体取出的细胞或组织进行实效培养。实效培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。 原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。用于传代培养的称为传代细胞。 原代细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能渡过“危机”而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传代40-50次，并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种传代细胞称为细胞株。细胞株（cell strain）： 由能进行无限次传代培养的细胞群称为细胞系。

19、细胞系细胞与体内原来的细胞比，其形态、结构、遗传上存在不同程度的变异。细胞系（cell line）： 细胞系细胞的特点是染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体，接触抑制丧失，容易传代培养。如Hela细胞系、BHK21细胞系、CHO细胞系等。Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养1、贴附型细胞（1）成纤维细胞型细胞 细胞长梭形,核圆位中央,胞质常外伸2-3个长短突起,多数细胞排列疏散,有较大细胞间隙,有时也相互平行排列，成群细胞呈放射状、旋涡状等形式。（2）上皮型细胞 类似上皮细胞而故名。细胞扁平状，排列较规则，贴壁后呈三角形及不规则扁平多角形，中央有偏圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞

20、，相互拥挤呈现“铺路石块状”，局部可形成单层上皮“膜片组织”。（3）游走型细胞 在支持物分散生长，一般不连接成片形成群落；细胞质常伸出伪足和突起；在培养皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则；细胞内易出现色暗吞噬颗粒；细胞外形不规则且多变，细胞密度增大连接成片时，形状类似成纤维细胞型或上皮细胞型。（4）多形型细胞 常见形式：神经细胞和神经胶质细胞。 细胞多形不规则。其不规则形态不象成纤维细胞那样由胞质突起所致，而是一般分胞体和胞突两部分，胞突细长，胞体多形不规则。2、非贴附型细胞 细胞体外生长时不贴壁，在悬浮培养液中生长而故名，又称悬浮型细胞。细胞呈球形。 常见形式：

21、血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交细胞、转化细胞系等。 培养时，细胞密度大，培养效率高，操作方便，易于大规模生产。 （1）单倍体细胞培养： 用花药在人工培养基上进行培养。可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；也可通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。 （2）原生质体培养 （二倍体体细胞培养）： 用纤维素酶去掉细胞壁得到原生质体，后者在无菌条件下生长分裂，经诱导分化最终长成植株。也可通过不同植物的原生质体进行融合的体细胞杂交长成体细胞杂交植株。植物细胞培养 细胞培养细胞分化的定向诱导细胞融合显微注射等二、细胞工程细胞工程使用的主要技术有： 融合细胞（杂交细胞）在培养过程中会发生染色体丢失。 凡亲本细胞亲缘关系比较近的，连续培养中染色体丢失慢。人、鼠杂交细胞中，人的染色体丢失很快。细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象称细胞融合。动物细胞融合：灭活病毒（如仙台病毒） 聚乙二醇（PEG）植物细胞融合时先要用纤维素酶去掉纤维素壁。电融合技术：悬浮细胞在低压交流电场 （100-200V/cm）中聚集成串珠状细胞群或将相互接触的单层培养细胞，加高压脉冲促使融合。免疫小鼠获得小鼠脾