聚酮化合物及其组合生物合成

1、聚酮化合物及其组合生物合成【关键词】聚酮化合物；,聚酮合酶；,组合生物合成摘要：聚酮化合物的组合生物合成是当前国际化学与生物学交织学科研究的热门之一，也正在生长成为药物创新超通例的紧张本领。本文对近十年来聚酮化合物，特别是I型聚酮化合物的组合生物合成的常用技能和要领学生长举行了回首和预测。关键词：聚酮化合物；聚酮合酶；组合生物合成ABSTRATPlyketidepundsandthEirbisynthesisbybinatrialappraheshadreeivedgreatattentinasarssdisiplinarysubjetinanefiledfheialbilgyfritsipr

2、taneandgreatptentialtreatebrandnedruginfuture.Inthisrevie,ehpetsuarizeethdsandtehnlgieshihhadbeendevelpedverpasttenyearsrsfrtheiaginativedisveryfnvelplyketidepundsbybinatrialbisynthesis,hihinrprategeneti,heialandbiheial,biinfratiandbitehnlgialapprahes.KEYRDSPlyketide;Plyketidesynthase;binatrialbisyn

3、thesis1聚酮化合物及其聚酮合酶聚酮化合物是一大类由细菌、真菌和植物将低级羧酸通过一连的缩合反响产生的天然产物，它包罗许很多多具有按捺细菌(如红霉素、四环素)、真菌(如灰黄霉素、两性霉素)、寄生虫(如averetin、奈马克丁)、癌症(如多柔比星、enediynes)等活性的化合物，有些抗真菌聚酮化合物同时还具有免疫按捺剂的活性(如雷帕霉素、FK506)，它被普及地应用于医药、畜牧和农业。如今，这一化合物越来越为人们所器重，这重要是由于该化合物具有：(1)无可相比的生物学活性使之具有宏大的新药物开拓潜力和贸易代价，聚酮化合物所形成的药物已用于险些全部紧张的疾病治疗，每年的贩卖额凌驾了100

4、亿美元；(2)奇特的布局和合成机制为人们研究酶催化的分子机制、分子识别和卵白质的彼此作用提供了空前的契机；(3)聚酮合酶所具有的可塑性可以使人们便利地通过组合生物合本钱领来得到新的化合物1。如今已创造了不少于10000种聚酮化合物，而由之衍生出的新产物更是难以记数。聚酮化合物是成效和布局最多样化的天然产物之一，它们的合成包罗酰基辅酶A活化羧酸的一系列重复的醇醛缩合而形成有必然长度的聚酮链骨架，然后颠末环化大概芳香化、大概与脱氧糖等布局单元毗连等历程。只管聚酮化合物的布局和特性千差万别，总的来说它可以分为两大类：芳香族聚酮化合物和复合聚酮化合物。前者是乙酸通过缩合(起始单元除外)形成的大部门酮基

5、在酰基链的延伸和完成后都不停保持非复原状态，颠末折叠和醇醛缩合形成六元环，芳香环随后被脱水复原，如放线紫红素、柔红霉素、四环素。复合聚酮化合物比芳香族聚酮化合物在布局变革上大的多，其构成单元有乙酸、丙酸和丁酸等，并且由于与芳香族聚酮化合物在合成化学、酮基复原历程、侧链的空间位阻上的本质差异，很多不颠末折叠和芳香化，而是通过内酯化成环，另有一部门仍保持酰基链，如大环内酯抗生素红霉素和螺旋霉素、抗真菌抗生素雷帕霉素和两性霉素、聚醚类抗生素莫能霉素和南昌霉素、抗寄生虫抗生素averetin等。聚酮化合物是通过聚酮合酶(plyketidesynthase,PKS)催化形成的，其催化历程雷同于脂肪酸合酶

6、(fattyaidsynthase,FAS)催化的脂肪酸生物合成，即通过酰基A活化的底物之间的重复脱羧缩合而合成2，3，但两者在合成单元的选择(包罗起始单元和延伸单元)、链装配历程中每个酮基复原程度的操纵、以及芳香聚酮或复合聚酮链长的决定等方面也存在着显着的差异，重要表如今：(1)FAS一样平常以乙酸作为起始单元，而PKS每每利用差异的起始单元，最为常用的有乙酸、丙酸，别的另有丁酸，杀假丝菌素利用的对氨基苯甲酸等，而averetin所利用的起始单元可多达40余种；(2)FAS一样平常只用乙酸为链延伸单元，而PKS除了利用乙酸作为链伸长单元外，还可利用丙酸或丁酸，在终产物中相应天生甲基或乙基侧链

7、；(3)PKS可以通过酮基选择性地复原和脱水，从而在终产物的相应位置形成酮基、羟基、双键或亚甲基等成效团，同时也决定了手性中央的立体化学构型。如今已经展现的聚酮合酶可以分为三类：型、型和型4。研究和报道最多和较为透彻的是型PKS，它是由几个多成效的多肽构成，每一个多肽上都别离携带有到场聚酮生物合成所必须的种种酶的布局域(dain)，每个布局域只到场整个聚酮碳链构建中的一步生化反响(nninterative)，而到场一轮聚酮生物合成反响的全部布局域称为一个合成酶单元(SU,synthaseunit)，编码这个合成酶单元的DNA称为一个模块(dule)。型模块布局的PKS就如同在轨道上行驶的一列火

8、车，在出发点由特定的“搬运工酰基转移酶(ayltransferase,AT)把差异的起始单元装车后，通过“装配工酮脂酰AP合成酶(ketaylAPsynthase,KS)颠末缩合反响将差异的“质料羧酸起始或延伸单元举行组装，随着火车的运行，不竭地从一个“停靠装配站酰基载体卵白(aylarrierprtein,AP)到下一个，聚酮链也不竭地得到延伸，半途按照模块构成的差异和指令要求，在别的差异的“特别工种装配工脱水酶(dehydratase,DH)、烯醇复原酶(enylredutase,ER)的作用下相应地举行复原(形成羟酯键)或脱水(形成,烯醇酯键)或进一步复原(形成饱和的亚甲基)，直至到达尽

9、头，在“装卸工硫酯酶(thiesterase,TE)的帮助下，完成末了的工序并将聚酮前体产物从PKS上卸载下来。这种PKS模块布局的创造有其非同平常的意义。只管种种聚酮化合物布局各异，PKS模块的底物特异性决定了I型PKS对起始单元和延伸单元的选择，而PKS每个模块上复原布局域的种类那么使聚酮产物得到差异程度的复原。复合聚酮化合物布局的多样性来自聚酮骨架构成单元的多样性和每个碳单元的差异复原程度，这意味着聚酮抗生素的布局具有相称大的可塑性，故可通过模块内或模块间的公正重组，方案出新基因(簇)构成或新的生物合成途径，这也是I型PKS作为组合生物学重要研究工具的紧张缘故原由之一。型PKS是一个多成

10、效酶复合体，只包罗一套可重复利用(interative)的布局域，每一布局域在重复的反响步调中被屡次地用来催化雷同的反响，其初次报道是在1984年5。以来自S.glauesens的芳香族聚酮化合物tetraenyin研究的较多6，只管已经创造了影响链长的两个链长决定因子(LF)KS和KS，但确切机制仍旧不是非常明晰。对型PKS的研究比年来也获得了一些希望，如Ba等7对柔红霉素产生菌S.peuetius的研究效果表现，dps基因决定了生物合成的起始单元，Dps埋头性地利用丙酰A为起始单元，一样平常来说，型PKS的起始单元均为乙酰A。别的，Bisang等8寻到了型PKS和型PKS的链长因子之间的配

11、合点，这是型和型PKS有机接洽的一个切入点。他们创造型PKS的KSQ(被以为大概是类PKS的链长因子)及型PKS的LF和型PKS的KS布局域雷同，惟一的区别是KS的活性中央残基半胱氨酸被高度守旧的谷氨酰胺代替，这个氨基酸对这一布局域的脱羧酶活性以及聚酮化合物的合成具有紧张的作用。和型PKS相比力，型PKS在起始单元和延伸单元的选择方面变革不大，以是它的布局多样性重要是来自于聚酮合成后的修饰步调。1999年，日本东京大学的Funa等9创造了一种雷同苯基苯乙烯酮合成酶的PKS(halnesynthaselikePKS)RppA，厥后被称为型PKS。RppA是一个在链霉菌中创造的与芳香族聚酮化合物苯

12、基苯乙烯酮合成相干的酶，它是一种同二聚体酶并可重复举行缩合反响(interative)，催化芳香族聚酮化合物淡黄霉素(flavlin)生物合成。催化苯基苯乙烯酮(很多黄酮类化合物的前体物)形成的苯基苯乙烯酮合成酶被以为是植物所特有的，然而来自S.griseus的rppA基因所编码的一个372个氨基酸的卵白却与苯基苯乙烯酮有着很大的同源性，它以丙酰A作为起始物，举行4个延伸反响将五肽开释和环化成为1，3，6，8四羟基萘(THN)，THN将会被氧化成淡黄霉素，然后聚合成种种有色的化合物。由RppA催化合成的THN不但是玄色素照旧种种含萘醌环的次级代谢产物的中央产物。型PKS和别的两种PKS迥然差异

13、，它们不依靠于作为酰基载体的AP及其上的4磷酸泛酰巯基乙胺。型和型PKS经常通过AP活化酰基A的底物，而型PKS直接作用于酰基A活化的简朴羧酸。只管布局和机制不雷同，但全部范例的PKS都是通过酰基A的脱羧缩合和KS布局域或亚基催化键的形成。在进化干系上型PKS与别的PKS及的FAS也相距甚远。在已往的十年里，随着生物合成基因簇克隆要领学的创新以及DNA测序技能和生物信息学的不竭生长和研究效果的不竭积聚，人们对付PKS的熟悉越来越全面，也越来越深化，但人们不禁照旧想知道我们毕竟对PKS相识几多？如今越来越多的报道表现型、型和型PKS并不克不及完全席卷不竭涌现出的新的聚酮合酶4。从布局的角度来看，

14、有些型PKS的布局域也可以是被重复利用的，如Avi、al5、NsB、SgE和alE8等；有些型PKS的布局域也可以是不克不及被重复利用的，如NnJKPQU；有些PKS好似是型PKS和型PKS的杂合体，如LnIJ/LnG和PedFG/PedD。从机制的角度来看，有些PKS依靠AP，而有些PKS不依靠AP。从合成的角度来看，有些PKS即可以催化形成键，也可以催化形成键，如NnJK。大概，我们面前所创造和利用的PKS只是整个PKS庞各人族中的小小一员，更多更出色的内容正等候人们去展现。2聚酮合酶的组合生物合成自从以英国约翰英纳斯中央(JhnInnesentre)的DavidAHpd为先驱的研究职员在

15、链霉菌形式菌种天蓝色链霉菌(Streptyeselilr)中创立和生长遗传操纵体系以来，链霉菌的分子遗传学不停成为国际生命科学范畴的一个热门。颠末三十年普及而深化的研究，此中抗生素生物合成基因的克隆在抗生素范畴已产生了深远的影响。起首，这些基因的克隆和测序使我们对抗生素的特性有了新的熟悉，比方，对抗生素生物合成基因成簇摆列纪律的创造极大地帮助了新基因簇的克隆和阐发。当代分子生物学技能使人们对抗生素有了更深化的相识的第二个方面是对聚酮类抗生素的熟悉。抗生素布局种类繁多，然而它们傍边的最宏大的一类，包罗大环内酯类、聚醚类、多烯类、蒽环类等都是通过聚酮合酶途径合成的，聚酮链合成的底物选择、复原程度和

16、产物的立体化学构型都是由PKS上相应模块中的布局域决定的，每个布局域的成效都逐一对应在终极产物的布局上，这种多成效模块化PKS中催化活性中央和化学合成步调及终产物化学布局的逐一对应干系，使得通过编纂生物合成基因来方案杂合产物成为大概，并由此产生出一个极新的研究范畴聚酮合酶的组合生物学。聚酮合酶的组合生物学就是通过基因工程等相干技能报酬地对产生抗生素等微生物次级代谢产物合成途径举行公正的改革，由此产生非天然的杂合基因或基因簇，从而形成新的非天然的天然聚酮化合物，与传统组合化学的重要区别是它是在基因程度上由微生物来合成天然界本来并不存在的新化合物，并且这种化合物的数量是惊人的。可以从理论上来推算一

17、下通过聚酮合酶的组合生物学所衍生的聚酮化合物的潜力(P,binatryptential)10。P=ATLATE4ATL代表卖力加载差异起始合成单元的AT布局域；ATE代表卖力加载差异延伸合成单元的AT布局域；4代表由酮基的经差异布局域催化形成产物的大概性；代表基因簇中模块的数量。这还不包罗AT两种立体化学大概性、KR布局域两种立体化学大概性、加尾酶等别的大概增长产物数量大概性的因素。以一个像红霉素如许典范的包罗6个模块的PKS基因簇为例，假设含有3种范例的AT(识别加载丙二酰A，甲基丙二酰A，乙基丙二酰A)，那么大概形成的聚酮化合物的理论值就靠近10000000，这就为聚酮库的创立奠基了稳固的

18、理论基矗纵览聚酮合酶特别是型PKS组合生物学近十年来的生长，归纳起来采取技能有如下几种1132。2.1聚酮合酶中模块的淘汰聚酮链的构成单元与催化它形成的PKS模块是逐一对应的，因此，聚酮链的长度可以通过改变延伸单元模块的数量来完成，条件是末了一个模块和环化酶布局域必须可以或许识别非天然的中央产物。如前所述，在红霉素PKS中，除了交融于模块1中的两个起始加载布局域(ATL和APL)和模块6中的TE布局域外，有六个链延伸模块别离位于DEBS1、DBS2和DEBS3中，红霉素合成历程中内酯环的巨细由DEBS中模块数决定，利用基因工程要领重新调解TE的位置，使TE重新和一个、两个、三个或五个DEBS模

19、块组合，效果产生了新的截短了的PKS，并合成了预期的二酮、三酮、四酮和六酮化合物，除二酮外，别的的几个聚酮化合物都以内酯环情势存在18，3336(图1)。这些实行表白，环化酶具有较广的底物特异性，它的重新定位可以产生种种链长的聚酮。2.2聚酮合酶中模块的增长在基因中添加模块直至2001年才得到乐成。Re等将来自S.hygrspius合成雷帕霉素PKS的模块2、模块5别离插入截短的DEBS1TE模块1和模块2之间，合成了在相应位置多出一个布局单元的四酮化合物；将雷帕霉素PKS的模块2、模块5别离插入全长DEBS的模块1和模块2之间，那么合成了多出一个布局单元十六元环的聚酮化合物36(图2)。2.

20、3聚酮合酶中模块的更换在红霉素DEBS1模块1的N端，存在两个起始加载布局域(ATL和APL)，它们卖力红霉素合成第一步反响6dEB生物合成起始物丙酰A的选择和加载，因此这两个布局域也被称为起始加载模块(ladingdule，L)。差异的起始加载模块对底物的选择性差异，averetin的起始加载模块对起始物要求非常宽松，它可加载多达40余种差异化合物作前体37。arsden用averetin的起始加载模块代替红霉素的起始加载模块构建的糖多孢红霉菌突变体，通过添加差异的前体合成了新的13位为异丙基、2丁基等红霉菌A、B和D衍生物38(图3)。Pfeifer用泉源于合成利福霉素的起始加载模块更换红

21、霉素的起始加载模块也合成了在13位结合苯环的红霉菌衍生物39(图3)。2.4模块中布局域的淘汰关于PKS基因工程改革的第一例乐成的报道就是对红霉素PKS模块5中KR布局域的缺失失活。在红霉素PKS模子提出时，为验证模子的准确性，Dnadi等通过同源重组同框缺失DEBS3中模块5的KR5布局域的80个氨基酸，正如意料的那样，突变体合成了新的在5位是酮基的红霉素衍生物5，6didexy3yarsyl5xerythrnlideB39(图4)。这不但证明了6dEB生物合成模子的准确性，还给人们以极大的启发：在DEBS中布局域的成效和布局是相对应的；DEBS以及6dEB后修饰酶对底物的要求并不非常严酷，

22、突变产生的中央产物能被卑劣的布局域有用的加工利用。另一个雷同的实行是针对DEBS2模块4中烯酰基复原酶布局域(ER4)的成效失活，它衍生的大环内酯中67由单键酿成了双键40(图4)。别的，另有一些关于使布局域成效丧失的乐成报道，但重要是会合于与复原成效有关的KR、ER、DH布局域，这是由于它们决定了相应碳单元差异的复原程度，通过改变酮基的复原程度可以产生更多的杂合聚酮。2.5模块中布局域的增长酮基的复原程度不单影响聚酮碳骨架的多样性，并且影响内酯化的方法和以羟基为中介举行的其A：红霉素全长DEBS；B：只包罗模块1、2和TE布局域的截短了的红霉素DEBS；：只包罗模块1、2、3和TE布局域的截

23、短了的红霉素DEBS；D：只包罗模块1、2、3、4、5和TE布局域的截短了的红霉素DEBS图1聚酮合酶中模块淘汰表示图A：只包罗模块1、2和TE布局域的截短了的红霉素DEBS；B：在截短了的红霉素DEBS模块1、2之间增长了一个来自雷帕霉素PKS的模块2(灰色区)；：在截短了的红霉素DEBS模块1、2之间增长了一个来自雷帕霉素PKS的模块5(灰色区)；D：红霉素全长DEBS；E：在全长红霉素DEBS模块1、2之间增长了一个来自雷帕霉素PKS的模块2(灰色区)；F：在全长红霉素DEBS模块1、2之间增长了一个来自雷帕霉素PKS的模块5(灰色区)它官能团与聚酮的结合。KR布局域的增长或KRDH布局

24、域的增长或KRDHER布局域的增长，都有大概影响酮基的差异程度的复原而改变别的基团毗连以及改变内酯环化的位点。Daniel等将红霉素PKS的模块2的KR更换为来自于雷帕霉素PKS的模块4的DHKR，相称于模块2比本来多增长了一个DH布局域，使原有的羟基产生了脱水，形成了=双键16(图5)。同样，Ka等将DEBS模块2的KR更换为雷帕霉素PKS模块l的DHERKR也得到了一个新的八元环化合物。用来自雷帕霉素PKS的模块4的DH4KR4双布局域(灰色区)更换只包罗模块1、2、3和TE的截短了的红霉素DEBS的KR2布局域。2.6模块中布局域的更换差异PKS模块选用差异的聚酮链延伸单元，延伸单元的选

25、择是由每个模块的AT布局域操纵的，AT布局域的更换也可以导致新的聚酮化合物的产生41，比方，用RAPS模块2中具有丙二酰A特异性的AT2更换DEBS1TE中模块1中具有甲基丙二酰A特异性的AT1，产生了预期的两个新的三酮内A：只包罗模块1、2和TE布局域的截短了的DEBS；B：将averetin的起始加载模块(灰色区)代替红霉素的起始加载模块；：红霉素全长DEBS；D：将利福霉素的起始加载模块(灰色区)代替红霉素的起始加载模块图4聚酮合酶模块中布局域淘汰表示图图5聚酮合酶模块中布局域增长表示图酯，这两个新产物在内酯环的4位都缺少了一个甲基42。在别的一个实行中，用丙二酰A特异性的三个异源AT布

26、局域来更换甲基丙二酰A特异性的DEBSAT1或AT2布局域，也产生了新的红霉素衍生物。Lin品级一次实行在全长的PKS中举行布局域的更换，他们将红霉素PKS模块6的甲基丙二酰埋头性AT更换成来自于雷帕霉素PKS模块2的丙二酰埋头性AT，效果在产物中产生在2位缺少一个甲基侧链的新化合物(图6)。在6dEB的立体布局中，其羟基有S和R两种构型，而羟基的构型由相应模块中的KR酶域决定，通过更换KR酶域可以改变6dEB的立体布局。比方用雷帕霉素KR2更换红霉素DEBS3中的KR6合成了3位羟基差向异构的6dEB衍生物22。2.7前体引导下的新聚酮化合物的合成除上述要领外，还可用粉碎PKS模块1的KS布

27、局域活性，再通过添加得当前体合成新的聚酮化合物43，44。Jabsen等实行了用差异前体产生化合物的构思44，他们起首得到了红霉素合成途径中第一步缩合步调被阻断的突变株，然后再通过外加差异的人工合成的小分子化合物，得到差异的聚酮化合物(图7)。3预测自1990和1991年英国剑桥大学的PeterLeadlay和美国Abbtt实行室的LenardKatz在红霉素生物合成途径中第一次展现基因和酶所具有的模块特性以来45，46，通过遗传工程对模块PKS基因举行可猜测的人工改革已被各国研究职员所证明，利用模块或布局域增长、淘汰、更换等多种组合生物学本领方案和改革基因簇，形成一系列非天然的天然性化合物，

28、在药物创新方面获得了一系列打破，这种打破不但具有其紧张的底子理论的代价，也具有埋伏的应用远景，但仍旧存在很多未解之谜和艰巨挑衅值得人们举行更深化研究和探究。一个紧张的挑衅就在于只管如今人们可以对症下药地对PKS模块或布局域举行基因的定向操纵，但要面对息争决的题目是这些产生了生物合成途径变革所产生的新的布局中央体怎样被卑劣的模块或布局域或后修饰基因所“等量齐观予以采取而发挥作用？这直接影响整个流水线的顺遂运转和末了产量。随着人们的积极，越来越多的呈模块布局的聚酮生物合成途径被创造，但仍旧还不明晰哪些模块或布局域必须存在于同一个多肽中才气发挥作用？哪些模块或布局域可以以单个卵白的情势来发挥成效？在

29、如许一条装配线上，假设可以装配的单个部件越多，那么可以想象通过摆列组合所形成的产物的种类就越富厚。只管云云，某个改革的特定的生物合成途径如今只能产生一个或少数多少个新的产物，它仍旧属于低通量，还无法“为所欲为、“十拿九稳地产生一整套包罗多个差异突变的PKS，从而一次性地得到布局特定并且种类繁多的新的聚酮化合物库，这另有待于人们对聚酮中央物在PKS差异模块之间转运纪律的深化展现。别的，很多聚酮化合物在合成的初期每每是没有生物学活性的，只有当其从PKS装配线上开释下来后颠末一系列差异的后修饰，如氧化、糖基化等历程才终极完成。因此，这也为通过组合生物合成制造新产物提供了时机，比方可以通过改革和更换相

30、应的后修饰基因来实现产物创新。除了对现有基因的报酬改革之外，人们还在继承从天然界中探求更多、布局更新奇、活性更特别的新的“原质料，在这些新的原质料创造的同时，也大概陪同着新的生物合成途径的展现，这无疑也为新的非天然“天然产物的制造带来新的方案蓝图。另一个挑衅来自于从技能和应用的角度可用于聚酮化合物高效表达的宿主体系的生长和应用。参考文献1DanielR,EbertKhslaS,HpdDA,etal.EngineeredbisynthesisfnvelplyketidesJ.Siene,1993,262:15462HpdDA,SheranDH.leulargenetisfplyketidesan

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