层析法理论精品课件

1、层析法理论第1页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三层析法 基本原理 层析法的分类 几种常用的层析方法： 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析第2页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三基 本 概 念层析法(色谱法、色层分析法、层离法）: 通过在固定相和流动相之间的物理和物理化学分配而将混合物中的两种或多种化合物相互分离的方法之总称. 叶绿素叶绿素叶黄素， 叶黄素茨维特色谱图 （1906）第3页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三基本原理 利用混合物中各组分的理化性质（如溶解度、吸附能力、电荷、分子量、分子极性、亲和力等

2、）各不相同，使各组分在支持物上移动速度不同而集中分布在不同的区域，借此将各组分分离。 第4页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三基本原理 所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶剂。 第5页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三层析的基本过程 组分A组分B+ 流动相固定相吸附溶解结合等解除上述作用反复进行组分A组分B移动速度不同第6页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三层析法的分类按两相所处的状态分类 液固层析法液液层析法液体气固层析法气液层析法

3、气体流动相固体液体固定相气相层析液相层析第7页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三层析法的分类按层析原理分类 各组份在流动相和固定相中的分配系数不同 分配层析法 固定相是固体吸附剂，组份在吸附剂表面吸附，对各组分吸附能力不同 吸附层析法 分离原理 名称第8页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同 凝胶层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂形成的盐键数目不同 离子交换层析法分离原理名称续上表第9页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三固定相只能与一种待分离组份专一结合

4、，以此和无亲和力的其它组份分离 亲和层析法 分离原理名称续上表第10页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三层析法的分类按操作形式不同分类 用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离 纸层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离 柱层析法操作形式名称将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离 薄膜层析法第11页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三几种常用的层析方法 吸附层析分配层析离子交换层析凝胶层析亲和层析第12页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三一、吸附层析（Absorption chro

5、matography） 吸附层析是利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行分离的一种方法，常用于分离易溶于有机溶剂而难溶于水的混合物。 比较常用的是吸附剂氧化铝和硅胶。吸附是可逆的，吸附层析就是吸附与解吸附的矛盾统一过程。第13页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三吸附剂和洗脱剂的选择 最大表面积和足够的吸附能力 对欲分离的物质有不同的吸附能力 与溶剂和样品不会发生化学反应 颗粒均匀，不会碎裂溶剂、洗脱剂：极性大的物质用极性大的洗脱剂第14页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三吸附柱层析 (Absorption column chromatograph

6、y) 吸附柱层析是利用玻璃柱盛吸附剂。样品溶液加入层析柱，溶质即被吸附剂（固定相）吸附。待样品液全部流入柱内的吸附剂后，再加入适当的洗脱液（流动相），使被吸附的溶质逐步解吸下来，随着洗脱液向下流动而移动，最后被分离。 第15页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三柱色谱法 (Column Chromatograph)机理: 吸附层析吸附剂: Al2O3, SiO2(硅胶), 聚酰胺等吸附剂和洗脱剂的选择:物质极性 吸附活性 洗脱剂极性 强 小 强 弱 大 弱装柱加入样品层析后常用洗脱剂极性次序:石油醚环己烷CCl4甲苯CH2Cl2CHCl3乙醚醋酸乙酯正丙醇乙醇甲醇 0.02

7、，A、B可分离.溶剂前沿起始线（原点）展开剂yx2x1层析缸层析纸与标样比较可定性鉴定第23页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三如果两种氨基酸的迁移速率相近，或者氨基酸的Rf值相同，如何来分离？第24页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三 氨基酸的Rf值展开剂正丁醇+吡啶+水 0.20 0.29 0.60 0.20 0.33 0.24 1 : 1 : 1正丁醇+醋酸+水 0.23 0.23 0.70 0.28 0.22 0.11 12 : 3 : 5天冬氨酸甘氨酸白氨酸谷氨酸丝氨酸组氨酸第25页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三例

8、：氨基酸混合液点在1515cm滤纸边2cm处，风干，展开剂用CH3OH-H2O-吡啶（20:5:1），当溶剂移动至14cm处，取出风干。（第一次展开） 将滤纸折成筒状，使斑点处于下方，再用叔丁醇-甲基乙基酮-H2O-二乙胺(10:10:5:1) 展开至14cm，取出风干。(第二次展开)显色：茚三酮-4-乙-2-甲氮苯-冰HAcxx第二次展开实验：氨基酸双向纸色谱法第一次展开第26页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三氨基酸双向纸层析色谱PC检测方法；颜色, 显色(反应显色, I2蒸气, 紫外灯照)剪下斑点，用适当的溶剂洗脱后测定(比色,荧光)第27页，共58页，2022年，

9、5月20日，19点18分，星期三+ + + + + + + o +o + o+ o +o + oo o oo + oo o oo o oo o o+ + + + + + + + + + + + + + + o +o + oo + oo o oo o oo o oo o oo o oo o oo o o o + o+ o +o o + + + o+ + + + + + +K+H+淋洗交换上柱溶液中的离子与离子交换树脂发生离子交换而分离.三、离子交换层析（Ion-exchange chromatography） 第28页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三A+BABAB柱层析离

10、子交换层析法将交换上去的离子， 用适当的洗脱剂依次洗脱而分离.第29页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三离子交换层析用于分离氨基酸、核苷、核苷酸等小分子物质比较理想.去离子水的制备？水的净化:阳离子柱阴离子柱混合柱离子交换分离法的应用第30页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三 离子交换分离操作技术树脂的选择和处理装柱交换洗脱树脂再生离子交换树脂玻璃纤维交换柱第31页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三离子交换层析离子交换剂的优点：（1）不溶性的高分子聚合物，具有立体网状结构，有较好的化学稳定性。（2）交换剂本身吸附能力弱，引入的可

11、以发生电离的活性基团。 （3）多孔性，表面积大，交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。CO O HCH2CHOHCHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH3CHCH3CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH3CHCH2CHCH2H2SO4SO3HSO3HSO3HSO3HSO3HSO3H+HC=CHHC=CHHC=CH（催化剂）n（分散剂）第32页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三阳离子交换分离（0.1molL-1 HCl为淋洗液）010020030

12、0400V洗(mL)cLi+Na+K+(2molL-1 HCl)K+亲和力大的先被交换上去, 后被洗脱下来.第33页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三树脂类型阳离子交换树脂: 含酸性活性基团的树脂。强酸型：RSO3H pH 0-14 不受酸度限制交换洗脱 弱酸型：RCOOH pH4 ROH pH9.5 选择性好, 可分离各种有机碱及氨基酸第34页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三强碱型：R N(CH3)3Cl pH 0-14弱碱型：R NH2 ， RNHCH3 pH 0-7 RN(CH3)2 pH 9.5螯合树脂：含有特殊的螯合活性基团交换洗脱 水化

13、作用阴离子交换树脂: 含碱性活性基团的树脂 第35页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三 树脂对离子的亲和力顺序强酸型阳离子交换树脂 对一价阳离子 Li+ H+ Na+ NH4+ K+ Rb+ Cs+ Ag+ Tl+ 对二价阳离子 Mg2+ Ca2+ Sr2+ Ba2+ Fe2+ Co2+ Ni2 +Cu2+ Zn2+ 水合离子半径越小亲和力越大强碱型阴离子交换树脂 F- OH- Ac- HCOO- H2PO4- Cl- NO3- HSO4- CrO42- SO42-对不同价态离子 Na+ Ca2+ Fe3+ Th4+ 电荷数越高亲和力越大第36页，共58页，2022年，5

14、月20日，19点18分，星期三四、凝胶层析（Gel chromatography） 凝胶层析是指混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 主要用于大分子物质的分离。第37页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三凝胶的种类和性质 交联葡聚糖凝胶 (Sephadex)琼脂糖凝胶 (Sepharose)聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel P)第38页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三分子筛效应 凝胶层析示意图第39页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三凝胶层析分子筛效应 全排阻：分子直径比凝

15、胶最大孔隙直径大，全部被排阻在凝胶颗粒之外另外，直径比凝胶最小孔隙直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。 第40页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三凝胶层析的应用 1、分离提纯蛋白质、核酸等生物大分子(脱盐)2、酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离精制 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩第41页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三层析柱的重要参数 柱体积Vt：凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。 Vt = 1/4 d2h 外水体积V0：层析柱内凝胶颗粒间隙的总容积。第42页，共58页，2022年，5月20日，19点18分

16、，星期三层析柱的重要参数 内水体积Vi：凝胶颗粒内部微孔的总容积。 Vi = W（凝胶干重）Wr（吸水值） 凝胶颗粒基质所占的容积Vr 峰洗脱体积Ve：被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积 第43页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三层析柱的重要参数分配系数Kd Kd = Ve - V0 Vi 第44页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三凝胶层析的实验技术 层析柱 (r、h）凝胶的选择 凝胶的准备 样品溶液的处理 防止微生物污染 第45页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三五、亲和层析（Affinity chromatography）

17、 亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 第46页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三第47页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三亲和层析 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等 第48页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三举例：mRNA的分离原理：以总RNA为起始材料，利用核酸的碱基配对原理，通过寡聚（dT）纤维素或者寡聚（U）琼脂

18、糖亲合层析从大量的RNA中分离mRNA。方法：（1）oligo(dT)-纤维素层 析柱法（2） oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法（3）磁珠分离法第49页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三oligo(dT)-纤维素层析柱法第50页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三磁珠分离法第51页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三配体与载体结合（固相化）装柱（亲和层析柱）亲和吸附（生物高分子与配体专一结合）解吸附洗柱亲和层析的基本过程第52页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三配体与载体的联接方法吸附法：配体吸附于固相载体或离子交换剂上共价偶联法：配体通过化学共价键联结于固相载体交联法：依靠双功能试剂造成分子之间交联，聚集成网状结构。 包埋法：配体被包裹于凝胶格子或聚合物的半透膜微胶囊中。 第53页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三亲和层析的应用 亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。第54页，共58页，2022年，5月20日，19点18分，星期三亲和层析的应用纯化生物大分子 稀溶液的浓缩 从纯化的分子中除去残余的污染