miRNA功能筛选鉴定

1、miRNA 功能筛选鉴定尽管目前在各种物种中发现了成千上万个miRNA，但已经鉴定功能的miRNA却少之又少。miRNA通常与靶基因mRNA 3 UTR区发生相互作用，进 而关闭或抑制基因的表达，30%的基因表达受miRNA调控，影响到细胞增殖， 细胞凋亡，细胞分化及相关信号通路等生命过程。一、miRNA功能筛选方法高内涵筛选(High Content Screening， HCS)是一种能够进行荧光显微成像 和定量图像分析的自动化筛选技术，能够在细胞水平进行系统性定量分析，利用 各种荧光标记物(如Hoechst、GFP、荧光抗体等)来检测各类药物对细胞作用 的多维信息，分析特殊分子靶位和生物

2、特征，是药效结构发现、药物靶标确认、 RNAi 筛选、药物先导物优化和药物毒性评价的技术平台。二、 miRNA 功能研究工具：miRNA mimicmicrONTM miRNA mimic 是运用化学方法合成的 miRNA 模拟物，能模拟细 胞中成熟miRNA的高水平表达，以增强内源miRNA的调控作用，进行功能获 得性(gain-of-fUnction)研究。miRNA inhibitormicrOFFTM miRNA inhibitor是化学合成的，经过特殊修饰的miRNA抑制 剂，通过特异性地与成熟miRNA分子结合而抑制其作用，可以削弱细胞中 miRNA导致的调控作用，从而进行miRN

3、A功能缺失性(loss-of-function)研 究。可以用来筛选miRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影 响细胞生长、增殖等过程的 miRNA。miRNA agomirmicrONTM miRNA agomir 是经过特殊化学修饰的 miRNA 激动剂，通过模拟 内源性miRNA进入miRISC复合物来调节靶基因mRNA的表达而发挥作用。 与普通的miRNA mimic相比，miRNA agomir在动物体内具有更高的稳定性和 miRNA活性，更易通过细胞膜，组织间隙而富集于靶细胞。在动物实验中可以 用全身或局部注射等方法进行给药，作用效果持续时间可长达6周。miRNA

4、antagomirmicrOFFTM miRNA antagomir 是经过特殊化学修饰的 miRNA 拮抗剂，通过 与体内的成熟miRNA竞争性结合，阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配 对，抑制miRNA发挥作用。miRNA antagomir 均为 miRNA 成熟链的反向互补序列，全链进行甲基化修饰，在 5 端和 3 端分别有 2 个和 4 个碱基硫代修饰，并在 3 端连接有高亲和 性胆固醇修饰。与普通抑制剂相比，micrOFFTMmiRNA antagomir在动物体内外 具有更高的稳定性和抑制效果，更易通过细胞膜、组织间隙而富集于靶细胞。 miRNA antagomir 在细胞

5、实验中转染效率更高，甚至不需要转染试剂，从而避 免了转染试剂包装过程的复杂步骤及其对实验的影响。在动物实验中可用全身 或局部注射等方法进行给药，作用效果持续时间可长达 6 周。三、miRNA功能分析方法1)miRNA 过表达选择依据Pt较项目miRN A rniinksmiRNA agoiniimiRNA piecLiffsormiRNA vetiOT序列长度对hp左:右2Jbp左右SOnlEObp左右化学舍咸序到粪世双 ENA)?ORNA羊链収縫DN丸制普所需时间4天=1間1-2 fS1-2 JS2-3J9S化学園怖悔记储怖朗方法更参可FrJQA高高高申等miKrA ftiil可控制可控制可

6、控剧不可控制同时奁达釦b miRNA屁合转染可懼混合转染可朝混合轻楽可以AIMtt小个小中等中零高中等高乍邑否用于动摘宾验不好可蔗不好匪否竪合进旱因殂不可不可不可ft学合咸比学合成闊粒扩増是否睛饗怖内Dtr晦作 用不需婪2)miRNA 抑制方法的选择比較项目miRNA inhibitorfniKNAaatagomirmiRNA sponge序列长度23皿23ntISObp左右优学合成序列，倾单誰KNA单能RNA职链DNA制备所需时间4-2 周Z周2V周化学幔怖标记可以，且修饰右法更多不可以转染戏率高土_ 中等细胞毒性小小申暉稳宦性中等蠡咼能否用于长敷抑制不可TrF可以能否用于动物实验不好能否整合进基因组不可不可可以检测总体转架数率不可可以再枚制备肩式化学合屈优学&尿质粒扩噎3）基因表达谱芯片miRNA通常与靶基因mRNA 3 UTR序列发生相互作用，导致