临床生物化学：第21章 临床生化检验方法与试剂盒评价

1、临床生化检验方法与试剂盒评价第2页教学目标与要求 掌握校准品的分类和正确使用；测定系统的概念和比对；试剂盒的性能指标和评价方法。 熟悉方法学性能指标和评价；量值溯源和量值传递的概念；液体双试剂的优点。 了解试剂盒的分类和发展趋势。第3页第3页第3页 临床生化检验方法的性能评价 临床生化检验试剂盒的性能评价 临床生化检验方法分级和标准品 主要内容第4页临床生化检验方法分级 一 二 三第一节 临床生化检验方法分级和标准品 临床生化检验的参考物质和校准品 量值溯源检测系统的比对 四第5页 是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法。决定性方法参考方

2、法 是指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。常规方法 是指性能指标符合临床或其他目的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，而且经济实用。 一临床生化检验方法分级第6页决定性方法（definitive method）也称为一级参考方法（primary reference method)参考方法（reference method）也称为二级参考方法（secondary reference method）常规方法（routine method） 推荐方法（recommended met

3、hod） 第7页表21-1 临床生化检验项目的决定性方法、参考方法、常规方法 项目决定性方法 参考方法 常规方法钙ID-MS原子吸收分光光度法邻甲酚酞络合酮法、偶氮胂法氯ID-MS、中子活化法库仑分析法硫氰酸汞法、选择性电极法镁ID-MS原子吸收分光光度法MTB 法钾ID-MS、中子活化法火焰光度法离子选择电极法、火焰光度法钠中子活化法火焰光度法离子选择电极法、火焰光度法清蛋白-免疫化学法溴甲酚绿法总蛋白-凯氏定氮法双缩脲法肌肝ID-MS离子交换层析法苦味酸法、酶法第8页表21-1临床生化检验项目的决定性方法、参考方法、常规方法 项目决定性方法 参考方法 常规方法尿素ID-MS尿素酶法二乙酰一

4、肟法、酶法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外）磷钨酸比色法胆红素-重氮反应法J-G 法、钒酸盐氧化法葡萄糖ID-MS已糖激酶法葡萄糖氧化酶法胆固醇ID-MSAbell-Kendall 法酶法第9页 （primary reference materials）也称一级标准品，与决定性方法平行，用于验证决定性方法、评价与校准参考方法，以及为二级标准品定值。 原级参考物质次级参考物质 （secondary reference materials）也称二级标准品 ，二级标准品的定值源于一级标准品和参考方法，主要用于评价常规方法，也可为质控物定值。 常规校准品 常规校准品除少数项目如电解质用纯物质水溶液外，大多

5、数采用混合血清基质。 二临床生化检验的参考物质和校准品 第10页校准（calibration）是一个测试和调整仪器、试剂盒或者检测系统，以提供检测反应和所测物质之间的已知关系的过程电解质、酶类、其他生化指标应合理选择校准品第11页标准品校准品质控品一级标准品用高纯化学物质（纯度99.98%）直接通过称重配制的溶液。一般由国家标准计量局出具证书。二级标准品某种成分的浓度可用公认的参考方法测定。由参考实验室或权威学术组织出具证书，如SRM、BCR、IFCC。标准品(standard）可用做校准品(calibrater)考虑血清成分复杂、难以避免基质效应 ，建议用与新鲜血清相似的介质做校准品，校准品

6、的量值应有溯源性，不同测定系统赋值不同。质控品多是成分相对稳定的混合血清，分为定值和非定值、冻干或液体，添加了防腐剂和保护剂等。定值往往由试剂盒供应商委托几家实验室在特定测定系统上测得的均值和标准差。第12页标准品与校准品大多数定量的方法（分光光度法、电化学、免疫定量）都需要用标准品校准，即通过标准比较来计算。用什么“标准”来校准？罗氏公司的C.f.a.s （calibrator for automation system），属于多项校准品，因使用方便，很多实验室都在使用。但前提是“指定的测定系统”。第13页图21-1 各级参考物质和校准品的关系及其量值传递过程第14页三量值溯源溯源性溯源性(

7、traceability）是指通过一条具有规定不确定度（uncertainty）的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准（通常是国家或国际测量标准）联系起来的特性，称为溯源性。其不间断的比较链称为溯源链第15页测量不确定度测量不确定度是指表征合理地赋予被测之值的分散性。是与测量结果相联系的参数，可理解为排除系统误差之外的所有随机误差的合成方差。第16页图21-2 量值溯源和量值传递途径理想的量值溯源的理想情况是可溯源至国际单位制（SI）单位第17页四检测系统的比对完成一个项目检验所涉及的仪器、试剂、校准品、质控品、操作程序、质量控制、保养计划等的组合称为检测系统（test

8、ing system）。常规检测系统有配套检测系统和自建检测系统。检测系统的概念第18页 .配套检测系统 自建检测系统 （一）检测系统的分类整个检测系统涉及的各个部分完全按照指定厂商要求配套使用。若该系统已经国家法定部门认证,则使用这样的检测系统对临床样品进行检验，其结果具溯源性。实验室自行建立的检测系统，如A制造商的试剂盒、B制造商的校准品、C制造商分析仪的组合。第19页（二）检测系统比对的实施步骤1. 制订分析质量目标 临床实验室根据临床需求和实际能力制订，包括允许不精密度、允许偏倚和允许总误差，可参照1988年美国临床实验室修正案（clinical laboratory improvem

9、ent amendment,CLIA88）。第20页2.对仪器性能进行评价 保证仪器处于良好的工作状态，具备可接受的精密度和准确度。3. 确定对比检测系统 比如具有溯源文件的HK法测定血糖的配套检测系统，并对该检测系统的性能进行验证，核实其准确度和精密度。第21页4. 评价检测系统的分析性能 评价内容至少包括精密度、准确度、可报告范围、分析灵敏度、分析特异性和参考区间等，应符合试剂盒制造商规定的要求。5.比对 同时用两个系统测定同一批临床样品和质控品，样品数量以40-100例为宜，每个样品平行测定2次，样品被分析物浓度应覆盖可报告范围的上限和下限。第22页6.可接受性判断 按照美国国家临床和实

10、验室标准研究院(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)建议的EP5-A和EP9-A2方案，对两个系统进行精密度评价和方法对比及偏差评估，并对可接受性进行判断。若符合分析质量目标，则该检测系统可以应用于临床。否则需对自建检测系统修改后重新比对。第23页制订分析质量目标 仪器性能评价 确定对比检测系统 内容初步评价检测系统比对允许不精密度、允许偏倚和允许总误差 准确度和精密度 参考系统或公认的测定系统性能指标40-100例（二）检测系统比对的实施步骤可接受性判断步骤第24页测定系统方法学操作程序校准品仪器试剂配方和来源测定系统的关键要素第

11、25页 1 2统一方法：以方法学评价为基础，提出参考方法或推荐方法。统一试剂的主要成分和测定条件。实施机构：国际临床化学学会、临检中心逐级溯源：常规校准品应向二级标准品、一级标准溯源。实施机构：ISO、国家标准计量局、参考实验室、试剂盒供应商、临床实验室全球性可比性战略实施33保证仪器良好的工作状态、严格的操作规程和质量控制、实验室内部测定系统的比对、实验室间的比对第26页方法学的性能指标 一 二 三第二节 临床生化检验方法的性能评价 方法学性能评价的内容 方法学评价试验 临床生物化学方法学性能判断 四第27页 可靠性 实用性 一 方法学性能指标准确度精密度方便性 经济性安全性 简单快速可测范

12、围第28页 准确度（accuracy）的传统定义是指测定值与“真值”的接近程度。是指一次测定的结果与被测物真值的接近程度。 准确度正确度 “正确度”（trueness），是指一系列测定结果得到的均值与“真值”的接近程度。通常以偏倚（bias）来表示 精密度 精密度（precision）是指在规定条件下，相互独立的检测结果间的一致程度。不精密度（imprecision）通常用标准差（S）和变异系数（CV%）来表示 第29页表21-3 临床生化检验方法的误差及评价方法系统误差误差分类评价试验评价指标理想结果比例系统误差回收试验回收率95-105%恒定系统误差干扰试验干扰值接近0比例系统误差方法对比

13、试验Y=a+bXb接近1.0恒定系统误差a接近0随机误差重复性试验（批内、批间、日间）、总不精密度CV3%二 方法学性能评价内容第30页三 方法学评价实验 美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）于2005年更名为临床和实验室标准研究院（CLSI）。制订了一系列评价方案（evaluation protocols，EP），包括:临床化学设备精密度评价（EP5-A）定量分析方法的线性评价（EP6-A）干扰试验（EP7-A）方法对比评价及偏差评估（EP9-A2）定量方法的初步评价（EP10-A2）定性方法的评价（EP12-A）基质效应评价（EP14-A）、。EP不仅可用来评价临床生物化学检验方法性

14、能，也可用以评价试剂盒和分析仪器的性能。第31页回收试验 干扰试验 线性试验 重复性试验对比试验检测限与检测范围批内批间 日内日间总不精密度三 方法学评价实验准确度第32页（一）重复性试验1.试验样品 一般选择2个，一个在参考区间附近，另一个为异常值2.初步的批内精密度评价：即一个样品重复测定20次，计算出均值，标准差和变异系数。用2个样品每天测定2批，批间测定间隔不得少于2h，每批平行测定2份，至少共测定20天，80个数据。每对结果间的差（共40个）代表批内差；2批均值之间的差（共20个）代表批间差；每天4个结果的均值（共20个）代表日间差。每批测定至少做一个质控。第33页（二）回收试验 所

15、谓回收即评定方法正确测定加入常规样品中的纯分析物的能力。 即在未知浓度的常规样品中加入一定量的待测组分，检测加入前后该组分的增加量，实际增加量与理论加入量的比值就是回收率。 目的是测定比例系统误差 。 第34页3. 回收率计算 加入浓度= 标准液浓度 回收浓度 = 分析样品测得浓度 基础样品测得浓度回收率（%）= 一般要求回收率95-105% 第35页（三）干扰试验干扰是指在测定某分析物时，受其他非分析物的影响而导致测定结果增高（正干扰）或降低（负干扰）。根据干扰的产生原因分为：基质效应、非特异反应、外部干扰物等。干扰试验的设计同回收试验，即将不同浓度的干扰物代替纯标准品。一般规定只对胆红素、

16、血红蛋白、脂类做干扰试验。干扰值加入干扰物后的测定值基础测定值 第36页（四）线性试验线性试验用来评价剂量和反应之间的线性关系，并把呈直线部分确定为线性范围（linear range）。线性范围指检测信号与被测物浓度呈线性时的被测物浓度范围。 1.样品浓度 线性评价至少应有5个不同浓度，可选择低值和高值样品各一份，低值样品和高值样品分别按体积3：1混匀、等份混匀、1:3 混匀，形成5个不同浓度。2.试验方法 将不同浓度的样品（X），随机排列，每个样品重复测定4次（Y），并要求在当天完成所有分析。 第37页 浓度范围应以分析项目的线性要求为准。 线性评价应有5个不同浓度，可选择低值和高值标本各一

17、个，低值标本为1号，高值标本为5号，二者3:1混匀为2号，等份混匀为3号，1:3混匀为4号，2-4号标本的浓度按下式计算： C2 = 3/4C1 +1/4C5 C3 = 1/2C1 +1/2C5 C4 = 1/4C1 +3/4C5第38页绘图 在坐标图纸上绘制X-Y（浓度-吸光度）关系图，观察线性关系。线性拟合 直线拟合方程为Y=b0+b1X； 抛物线反应曲线的拟合方程为Y= b0+b1X+b2X2； “S”形反应曲线拟合方程为Y= b0+b1X+ b2X2+b3X3数据整理与离群点检查线性失拟误差检查或非线性度计算 第39页（五）对比试验对比试验是指分别用两种方法测定一组不同浓度和病理情况的

18、临床样品，测定结果进行回归分析。比较方法应选择参考方法或公认的常规方法，测定偏差主要来源于评价方法。1.试验样品 应收集新鲜的正常和异常的临床样品，应有足够宽的浓度范围，各浓度样品数量应有合适的比例。2.样品测定 样品数至少为40个，每个样品用2种方法分别作双份测定。每天测定8个样品，双份测定时第一次按顺序1，27，8，第二次8，72，1，共测试5天。第40页（六）检测限检测低限通常是指能与适当的“空白”读数相区别的待测物的最小量。方法是做空白平行试验（一般20次），以蒸馏水调零，读取各次吸光度，计算均值（Ab）和标准差(S)。以Ab+3S表示与“空白”读数相区别的最小吸光度，将其换算成浓度，

19、作为该法的检测低限临床实验室以生物检测限更为重要，需采用接近检测低限的生物检测限样品来确定，能更真实地反映实际检测限水平样品测定的不确定度。第41页四 方法学性能判断在坐标图纸上绘制X-Y（浓度-吸光度）关系图，观察线性关系。第42页临床生化试剂盒的质量标准 一 二 三第三节 临床生化检验试剂盒的性能评价 临床生化检验试剂盒的分类 临床生化试剂盒的性能指标及评价 临床生化试剂盒的发展趋势 四第43页体外诊断试剂体外诊断试剂（in vitro diagnosis reagents）用于完成一个特定体外诊断检验，而包装在一起的一组组分。试剂盒组分可包括抗体、酶、缓冲液、稀释液、校准物、控制物或其它

20、物品和材料。 第44页 一 临床生化试剂盒的质量标准临床化学体外诊断试剂（盒）通用技术要求2006临床化学体外诊断试剂(盒)产品技术审评规范2011第45页 单液体型 液体双试剂 二 临床生化试剂盒的分类单液体型特别适用于半自动生化分析仪和小型自动生化分析仪。稳定性较差1.稳定性能好 2.可消除样品自身空白 3.提高抗干扰能力 4预反应多项同测组合试剂 浓缩试剂 第46页1.试剂空白吸光度 2.试剂空白变化速率 3.分析灵敏度4.线性范围5.重复性7.稳定性 8.临床试验 三 试剂盒性能指标和评价试剂盒6.准确度第47页第48页（一）试剂空白吸光度用蒸馏水调零，用指定的空白液加入试剂作为样品测

21、试，在测试主波长下，记录测试启动时的吸光度（A1）和约5分钟后的吸光度（A2），A2测试结果即为试剂空白吸光度测定值。 是判定试剂质量的一个有效指标 改良赖氏法测定ALT NADH底物 色素原底物 第49页第50页（二）试剂空白变化速率对于速率法试剂盒，用指定的空白液加入试剂作为样品测试时，在测试主波长下，记录测试启动时的吸光度（A1）和约5分钟(T)后的吸光度（A2），计算试剂空白吸光度变化率（A/min）。测定试剂空白吸光度变化（A/min），用来检查试剂在工作状态下的稳定性。但事实上，试剂空白吸光度变化速率无法反映试剂盒的稳定性，试剂空白吸光度变化速率主要反映干扰程度和仪器的稳定性。 第

22、51页（三）分析灵敏度用吸光度差值（A）或吸光度变化（A/min）来表示单位浓度的被测物反应所引起的信号变化，其含义类似摩尔消光系数。 分析灵敏度不是越高越好，以适合待测物检测范围为原则。分析灵敏度一般用于批间比较，较能反映制造商的配方、原料的一致性。 第52页（四）线性范围取高浓度样品和低浓度样品按不同比例混合成5个浓度做线性试验。 试剂（盒）的线性范围越宽，临床复测几率越小，但与样品/试剂比例成反比 第53页（五）重复性用质量控制血清测试33（3个批号，每个批号取3瓶）批间差，较能反映制造商的配方、原料的一致性。干粉或冻干试剂还需测定批内瓶间差，测定同一批号的试剂20瓶，用变异系数（CV）

23、来表示。 第54页（六）准确度1.相对偏差 直接用试剂盒测定参考物质（平行3次），评价测定均值与靶值的偏离程度。也可用由参考方法定值的高、中、低三个浓度的人混合血清，用试剂盒平行测定3次，计算均值与定值的相对偏差。 3.比对试验 既无参考物质、参考血清，也无标准品，也可用比对试验来验证准确度。 2.回收试验 测定试剂盒若有标准品，也可用回收率衡量比例系统误差。第55页（七）稳定性1.效期稳定性 取已到效期的试剂盒按以上评价方法对试剂盒性能指标进行评价。可作为审批的依据，但对该批次的试剂盒的稳定性意义不大。2.热稳定性试验 对同批次试剂盒稳定性目前没有很好的评价方法。生化试剂盒一般置2-8保存，

24、为了快速有效地评价试剂盒的稳定性，可以用加速试验来估计。 3.开瓶稳定性 也称在仓稳定性，是指试剂盒置分析仪试剂仓在使用过程中的稳定性。 第56页（四）临床试验1.要有临床机构伦理委员会确认的文件；2.在两家省级医疗卫生单位完成临床研究；3.新诊断试剂（盒）应与该诊断疾病的金标准针对临床样本进行盲法同步比较，应与已批准上市产品针对临床样本进行比对试验。4临床样本的要求：综合不同地区人种、流行病学背景、病原微生物的特性等因素选择研究单位，症状典型和非典型的，一般临床研究的总样本数至少为200例，新诊断试剂（盒）1000例。第57页适应生化分析仪的要求 酶法分析的应用 免疫比浊法的应用 四 临床生化试剂盒的发展趋势高灵敏度试剂盒的应用 提