分子生物学实验6琼脂糖凝胶电泳

1、实验六 琼脂糖凝胶电泳2015-04-09实验目的学习和掌握琼脂糖凝胶电泳进行DNA检测的方法；了解电泳过程中各种因素对结果的影响。琼脂糖 ( Agarose ) 是一种线性多糖聚合物 ,主要成分为多聚半乳糖，是从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质 , 其密度是由琼脂糖的浓度决定的。经过化学修饰的低熔点 (LMP) 的琼脂糖 , 在结构上比较脆弱 , 因此在较低的温度下便会熔化 , 可作为介质用于电泳。实验原理琼脂糖凝胶电泳兼有“分子筛”和“电荷”的双重效应。因此，不同分子量以及相同分子量但构型不同的核酸在琼脂糖凝胶电泳中都能够被分离开。核酸的

2、等电点偏酸，当处于电泳条件（PH=8）时，核酸链上带有负电荷，在电场力的作用下会向正极泳动。电泳主要是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。1. DNA 的分子大小: 线状双链 DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA 分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。影响因素2 DNA 分子的构象 相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不

3、一样的，超螺旋DNA移动最快。3 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状 DNA 分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA 电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA 分子的大小。凝胶浓度（%） 线性DNA长度（bp） 0.5 100030000 0.7 80012000 1.0 50010000 1.2 4007000 1.5 2003000 2.0 502000 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5-2%之间。低浓度胶可进行大片段核酸的分离，高浓度胶适合小片段核酸分析。分离小于0.5kb 的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb 的DNA 分

4、子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA 片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。4 嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15。溴化乙锭（简称EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，经紫外光透射仪激发可放射出橙红色信号。由于溴化乙锭可以嵌入核酸碱基分子中，因此，核酸在琼脂糖凝胶电泳时加入溴化乙锭染料，电泳后的凝胶放在紫外灯下观察，就可以呈现出橙红色的核酸条带。GelRed是一种灵敏、稳定和相对安全的荧光核酸染色试剂。它可以替代溴化乙锭，用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝

5、胶中核酸的染色。荧光强度与DNA含量及大小成正比5电源电压 在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。6 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA 几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。作用用于DNA检测分析作为制备技术，在采用某些方法【如质谱(MS)、聚

6、合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹】检测之前，部分提纯DNA分子.实验仪器用品及试剂配制（1）用具及设备琼脂糖凝胶电泳系统凝胶成像系统Walter Schaffner发明的水平板凝胶成像系统（2）药品及试剂配制TAE或TBE电泳缓冲液 TAE（Tris-乙酸缓冲液）：先配制50储存液：242g Tris、57.1ml冰乙酸、100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）。使用时，将50储存液稀释至1的使用液（0.04mol/L Tris-乙酸、0.001mol/L EDTA）。DNA显色剂Gelred显色剂：10,000储液6上样缓冲液称取40g蔗糖，加100ml双

7、蒸水溶解，配制成40%蔗糖水溶液。称取0.25g溴酚蓝，加入到100ml 40%蔗糖水溶液中，混匀，于4保存。电泳指示剂溴酚兰；二甲苯青作用：在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色，使加样操作更方便胶浓度（%）溴酚蓝二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb实验步骤2.配制1%琼脂糖凝胶称取0.8g琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加入80ml 1TAE缓冲液，瓶口倒扣小烧杯。在微波炉中加热煮沸至琼脂糖全部融化，取出后摇匀。加热过程中也要不时摇动锥形瓶，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。当琼脂糖溶液冷却大约至5060（锥形瓶表面感觉

8、稍烫手但可忍受），加入溴化乙锭（EB）母液（10mg/ml），使其终浓度为0.5g/ml，或按照10ml加入1l Gelred 10,000储液替代EB，迅速摇匀锥形瓶后，快速将琼脂糖溶液倒入准备好的制胶装置。琼脂糖凝胶厚度在35mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。在室温下放置约30分钟，琼脂糖溶液会凝固成凝胶状态。小心拔去梳子。拔去梳子后，在凝胶中显出一排加样孔。将制胶架从多用制胶器中取出，放入电泳槽内的水平平台上。在电泳槽中倒入与制胶相同的电泳缓冲液，缓冲液需要超过胶面0.5cm。1.准备制胶装置 选择并清洗合适规格的制胶架，将制胶架放入与其配套的多用制胶器中，将选择好适

9、合的塑料梳子也插入多用制胶器上。3、制样及点样从冰箱中取出标准DNA、DNA样品，溶化后进行制样。将6上样缓冲液与一定量的DNA样品按照1ul：5ul比例于封口膜上混合，增加DNA样品的密度。基因组DNA和质粒DNA样品都吸取3ul与6上样缓冲液混合， PCR产物吸取5ul与6上样缓冲液混合。将混合后样品使用微量移液器小心注入凝胶的加样孔中。注入DNA样品时，要将微量移液器吸头的尖端略微伸入加样孔中，但操作要小心，避免损坏凝胶或将加样孔底部凝胶刺穿。每加完一个样品，应更换一个微量移液器吸头，以防样品之间的污染。5.紫外观察并分析电泳结果 戴上一次性手套，将凝胶从电泳槽中取出，尽可能将所有的电泳

10、缓冲液淋干。将凝胶放入凝胶成像系统的多功能样品操作室中。打开紫外灯，通过凝胶成像系统操作软件，观察电泳结果。4.电泳 加完样后，盖上电泳槽盖，将电泳槽的电线与电泳仪连接。将靠近加样孔一处的电线与电泳仪负极连接，远离加样孔一处的电线与正极连接（注意正负极一定要连接正确），立即接通电源。 控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。 当溴酚蓝条带移动到距离凝胶前沿约1-2cm时，停止电泳。凝胶凝固后取出梳子铺胶加缓冲液电 泳点 样 a b c d e 23.2kb 9.4kb 6.5kb 4.3kb 2.3kb 0.1kb 0.5kb 2.0kbDNA重组电泳示意图a:基因组DNA；b:质粒DNA；c:质粒载体酶切后大片段；d：PCR产物；e：HindIII digest DNA marker注意事项1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 ，否则温度太高