分子生物学常用技术凝胶电泳

1、电泳基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。 德厚行远，因尔成道第一页，共三十九页。 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 德厚行远，因尔成道第二页，共三十九页。二、主要方法 有支持物的电泳技术： 1、纸上电泳 2、醋酸纤维薄膜电泳 3、薄层电泳 4、非凝胶性支

2、持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等) 5、凝胶支持体区带电泳 淀粉液 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 德厚行远，因尔成道第三页，共三十九页。 不用支持体的电泳技术： 1、Tiselius电泳 2、显微电泳 3、等电点聚焦电泳技术 4、等速电泳技术 5、密度梯度电泳 德厚行远，因尔成道第四页，共三十九页。DNA电泳德厚行远，因尔成道第五页，共三十九页。DNA分子带负电，向正电方向游泳德厚行远，因尔成道第六页，共三十九页。（一）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应

3、在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系德厚行远，因尔成道第七页，共三十九页。琼脂糖Agarose琼脂糖为链状多糖 绳状琼脂糖束大网孔型Melting at 85 and solidify

4、ing from 32-40 D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactopyranose. 德厚行远，因尔成道第八页，共三十九页。不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围琼脂糖浓度（%） 分离范围（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3德厚行远，因尔成道第九页，共三十九页。琼脂糖浓度（%） 分离范围（kb） 0.5 1.0 30 0.7 0.8 12 1.0 0.5 10 1.2 0.4 7 1.5 0.2 3 2.0 0.052德厚行远，因尔成道第十页，共三十九

5、页。质粒DNA分子有三种构型，即CCCDNA、OCDNA和LDNA，这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带，CCCDNA泳动最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNAEB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套CCCDNALDNAOCDNA电泳方向德厚行远，因尔成道第十一页，共三十九页。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型1当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形

6、结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；2如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；3若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型。德厚行远，因尔成道第十二页，共三十九页。琼脂糖凝胶中DNA的观察溴化乙锭（EB）DNA：紫外光下 红色荧光德厚行远，因尔成道第十三页，共三十九页。琼脂糖凝胶电泳主要实验器材电泳仪电泳槽缓冲液琼脂糖凝胶槽梳子取液器溴酚蓝德厚行远，因尔成道第十四页，共三十九页。电泳槽结构德厚行远，因尔成道

7、第十五页，共三十九页。操作步骤琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm观察：紫外灯下观察，照相德厚行远，因尔成道第十六页，共三十九页。溶 胶德厚行远，因尔成道第十七页，共三十九页。准备胶槽德厚行远，因尔成道第十八页，共三十九页。凝胶冷却至50C，加EB至终浓度0.5g/ml德厚行远，因尔成道第十九页，共三十九页。铺 胶德厚行远，因尔成道第二十页，共三十九页。凝胶凝固后取出梳子德厚行远，因尔成道第二十一页，共三十九页。加缓冲液德厚行远，因尔成道第二十二页，共三十九页。准备样品德厚行远，因尔成道第二十三页

8、，共三十九页。点 样德厚行远，因尔成道第二十四页，共三十九页。电 泳德厚行远，因尔成道第二十五页，共三十九页。注意观察溴酚蓝染液的迁移德厚行远，因尔成道第二十六页，共三十九页。紫外灯下观察电泳结果德厚行远，因尔成道第二十七页，共三十九页。照 相德厚行远，因尔成道第二十八页，共三十九页。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的作用下聚合而成可以分离小片段（5500bp）DNA分子聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：蛋白质分子的分离鉴定蛋白质分子量的测定核酸的分析核酸序列测定德厚行远，因尔成道第二十九页，共三十九页

9、。德厚行远，因尔成道第三十页，共三十九页。 迷你垂直型电泳槽德厚行远，因尔成道第三十一页，共三十九页。DNA序列分析电泳槽德厚行远，因尔成道第三十二页，共三十九页。中型双垂直电泳槽德厚行远，因尔成道第三十三页，共三十九页。蛋白电泳德厚行远，因尔成道第三十四页，共三十九页。（三）醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5g的蛋白质可得到满意的

10、分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 德厚行远，因尔成道第三十五页，共三十九页。（四）等电聚焦电泳技术 等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。 现在它经常与SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳构成二维电泳中的第一向，主要用于分离蛋白质。德厚行远，因尔成道第三十六页，共三十九页。IEF的基本原理 在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。 德厚行远，因尔成道第三十七页，共三十九页。德厚行远，因尔成道第三十八页，共三十九页。（五）SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分