实验6-微生物的生理生化反应

1、实验六微生物的生理生化反应1、实验目的探究菌株在碳源同化、氮源利用、乙醇发酵和抗生素效价分析等方面不同的生长特性，观察并简要分析不同微生物的生理生化特征及其形成机理。2、实验过程简述培养基与试剂准备2.1.1碳源同化培养基准备碳源为葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、蜜二糖、纤维二糖、海藻糖、松三糖、可溶性淀粉、a-甲基葡萄糖苷的YNB培养基，放入一根杜氏管。2.1.2氮源同化培养基准备氮源为硫酸铵，尿素，蛋白胨，硝酸钾，无氮源YNB的固体、液体培养基。2.1.3乙醇发酵用种子培养基：YPD培养基2.1.4乙醇发酵用发酵培养基葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，尿素，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙。2

2、.1.5抗生素效价测定用培养基：LB培养基2.1.6青霉素：用pH6.0磷酸缓冲液配制，浓度为100mg/ml，0.22|Jm孔径过滤灭菌。微生物的碳源同化和发酵1、从菌体斜面接一环菌于1ml无菌水中，室温静置2h。2、取200pl菌悬液，分别转接于含杜氏管的小试管中，静置培养48h。3、每24h观察记录生长和产气情况。4、根据实验结果判断不同菌株对不同碳源的同化或发酵。微生物的氮源利用1、从菌体斜面接一环菌于1ml无菌水中，室温静置2h。2、取200pI菌悬液，分别转接于上述培养基小试管中，30C或37C静置培养48h。3、各取20pl菌悬液，分别划线于不同氮源的固体平板上，待菌液被吸收后，

3、培养皿倒置，静置培养48h。4、每24h观察记录生长情况，48h测定液体培养物的OD600。5、根据实验结果判断不同菌株对不同氮源的利用能力或偏好性。酵母菌的乙醇发酵1、种子液培养：将酿酒酵母从菌种斜面上接一接种环至YPD种子培养基中，30C，200rpm，培养18h。2、乙醇发酵：按照10%(v/v)的比例将培养好的种子液接入100ml发酵培养基中，用无菌塑料布将封口密封，30C，静置培养，每24h手摇1次，发酵3-4d。3、乙醇测定：打开封口，可以闻到明显的乙醇气味，乙醇含量用配有乙醇酶膜的生物传感分析仪进行分析测定。同时测量发酵液残留的葡萄糖浓度和菌体量。4、依据测定结果计算发酵液中乙醇

4、含量、糖醇转化率及乙醇得率。抗生素效价分析管碟法测定抗生素效价:1、将加热融化好的LB培养基（约15ml）倒入培养皿中，冷却凝固，作为底层；2、另取15ml加热融化的LB培养基，冷却至约40C（以不烫手为宜），加入100ul菌液，混匀；3、将牛津杯放置在培养皿中的底层培养基上，然后将含有待测敏感实验菌的培养基倒入已凝固的底层培养基上面，均匀分布；4、培养基凝固后，将牛津杯取出，在培养皿底部分别注明“SH”、“SL”、“TH”和“TL”，用无菌枪头分别将20ul高浓度和低浓度的青霉素标准液加入到标记为SH和SL的牛津杯孔中，同时将20ul高浓度和低浓度的待测样品溶液加入到标记为TH和TL的牛津杯

5、孔中，盖上培养皿盖，静置30min；5、将培养皿置于37C培养箱中培养48h,每天观察菌体生长情况；6、待抑菌圈长出，用游标卡尺进行测量，测量时眼睛视线应与读数刻度垂直。注意观察抑菌圈是否圆整，测量时可对每个抑菌圈做两次互为垂直的直径测量。3、实验结果描述对不同碳源利用情况24h、48h观察两次，记录杜氏管产气、生长的情况。图124h观察结果从左到右分别为空白、a-甲基葡萄糖苷、纤维二糖、葡萄糖、淀粉、海藻糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、棉子糖、空白、松三糖。图248h观察结果从左到右分别为48h海藻、纤维二糖、a-甲基葡萄糖苷、空白、乳糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、空白、乳糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖。碳源

6、培养基葡萄糖半乳糖乳糖蔗糖麦芽糖纤维糖海藻糖松糖淀粉a-甲基葡萄糖苷棉籽糖对照24h产气0.800.91.00.5000000.70生长情况+48h产气1.001.01.01.0000001.00.1生长情况+表1碳源产气、生长情况蔗糖、乳糖、葡萄糖明显生长，产气情况为1；麦芽糖、棉籽糖产气较好，生长明显。氮源生长情况图3氮源平板划线24小时观察情况本人划线平板格子为编号3。无氮对照+0D值：蛋白胨+JMF+硫酸铵+尿素-氮源无氮源硫酸铵尿素酵母粉蛋白胨稀释倍数原液4倍4倍5倍5倍0D值0.4740.9310.7300.8540.755图4氮源平板划线48小时观察情况（因尿素没有生长故没有拍照

7、）固体平板生长情况：3.3葡萄糖-乙表2氮源0D值测量原始葡萄糖浓度10g/100ml使用生物传感器测定发酵液葡萄糖49，标准设定为0.1g/100ml对应值为100；1ml稀释100倍测量值为49，则含乙醇：4950=0.245g/L。原液中乙醇为：24.5g/L1ml原液测量值57则糖残量：57/100X100mg/100ml=0.57g/L消耗糖：100g/L-0.57g/l=99.43g/l糖醇转化率为：一乙醇得率：样品抑菌圈直径（mm）平均值（mm）SH0/00/00/00SL0/00/00/00TH0/00/00/00TL0/00/00/003.4抑菌大小测量：表3抑菌圈产生情况S

8、H：标准品高剂量的抑菌圈SL:标准品低剂量的抑菌圈TH：供试品高剂量的抑菌圈TL：供试品低剂量的抑菌圈x/y：每个抑菌圈垂直的两个直径图5抑菌圈产生情况抗生素效价计算比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价计算公式：W=(SH+TH)-(SL+TL)V=(TH+TL)-(SH+SL)0二D*antilog(l*V/W)0:供试品和标准品的效价比D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1I：高低剂量之比的对数，一般为log2或log4Pr=Ar*0Pr：供试品的效价Ar：标准品标示的效价因实验没有抑菌圈产生，故效价无法计算。4、实验结论4.1碳源利用从实验结果来看，菌株在蔗糖、

9、乳糖、葡萄糖明显生长，生长较快速，24h产气较多，可达1；麦芽糖、棉籽糖产气较好，生长明显，48h产气情况可达1，故对这几种碳源利用较好，对于纤维二糖、海藻糖、松三糖、淀粉、a-甲基葡萄糖苷不可以利用。氮源利用在氮源利用方面，菌株可以在无氮对照上生长，不可以在固体培养基上利用尿素，从OD值上判断该菌又可以利用尿素，故可能由于3/4两个实验组的培养基配置错误。综合考量酵母粉是该菌株最理想的碳源，次之为蛋白胨。抗生素抗性实验结果显示该菌株无法在青霉素上产生抑菌圈，由于缺少试验对照，并且别的小组也有没有抑菌圈的情况，初步分析认为并非实验操作失误，可能是该抗生素浓度较低或者失活，无法抑制该菌种生长。5、思考题酵母菌乙醇发酵过程中静置培养的目的？酵母菌发酵乙醇的代谢途径是什么？答：酵母菌乙醇发酵过程中静置培养是为了防止氧气进入从而无法进行无氧发酵。酵母菌发酵乙醇的代谢途径：酵母菌等产乙醇微生物可以在厌氧条件下通过糖酵解途径将含碳化合物转化为丙酮酸，然后通过脱羧反应生成乙醛，在醇脱氢酶催化下生成乙醇。菌液浓度是否影响抑菌圈的形成及大小？答：会影响。所以需要进行预实验确定合理的菌液浓度，保证抑菌圈的清晰。微生物对不同碳源和氮源的利用有何应用意义？答：1、微生物是生物地球碳循环和氮循坏过程