基于生物信息学方法的胰腺癌组织趋化因子CCL2相关差异基因表达及其预后价值

1、基于生物信息学方法的胰腺癌组织趋化因子CCL2相关差异基因表达及其预后价值趋化因子是一类由细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白，具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力，是主导细胞迁徙的关键调节剂，对恶性肿瘤的发展有极大影响。CCL2是趋化因子CC亚家族中的重要成员，为促进单核细胞及巨噬细胞迁徙的关键因子之一，已经证实，CCL2在多种肿瘤发展进程中发挥作用，通过抑制细胞凋亡、坏死和自噬等过程提高癌细胞的存活能力，并在肿瘤微环境中与其受体相互作用，调节单核细胞的趋化性从而导致肿瘤的发展。然而，CCL2在胰腺癌中的作用机制尚不明确。本研究通过生物信息学分析CCL2及其相关差异表达基因，探讨它们在胰腺癌组织中的

2、表达及其与患者预后的相关性。一、材料与方法1数据集的选择：从肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库下载178例胰腺癌患者的基因表达谱，从TCGA数据库的连接网站UCSC XENA下载178例胰腺癌患者对应的完整临床数据。2基因表达差异分析及相关性分析：根据CCL2基因表达量中位数，将178例患者分为高、低表达两组，以logFC=1且P0.05为标准，采用R/Bioconductor软件的limma包对比筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。采用R软件的corplot包对TCGA样本与CCL2基因进行

3、相关性分析，得到各个基因的相关系数，以相关系数的绝对值0.15为界限，选取相关基因与DEGs的交集，得到相关DEGs。根据178例患者的中位生存时间和生存状态，采用R软件的ezcox包进行批量COX回归分析，以P0.05为差异有统计学意义，筛选与预后相关的DEGs。3预后相关DEGs功能富集分析：使用R/Bioconductor软件的clusterprofiler包对预后相关DEGs进行功能富集分析，包括基因本体（gene ontology,GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes,KEGG）通路富集分析，其中GO包括细

4、胞成分、分子功能和生物学过程3个部分。4风险预测模型的建立与评估：采用R软件的glmnet包，用Lasso方法筛选变量，建立Cox回归模型，并计算基因的相关回归系数，获得预后相关DEGs模型。然后二次建模，根据回归系数加权建立胰腺癌预后风险评估公式，绘制生存曲线和受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic, ROC)，计算曲线下面积(area under the curve, AUC)，并将预测模型可视化为列线图。5统计学处理：采用R软件(3.6.0版本)进行统计学分析。应用Wilcoxon秩和检验分析CCL2关键相关基因在胰腺癌组织中的差异表达，计

5、量资料采用t检验，计数资料采用2检验。基因间的相关性采用Spearman相关分析，0.1|r|1.0时定义为存在相关；生存曲线采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。P0.05为差异有统计学意义。二、结果1CCL2相关差异表达基因及功能和通路富集分析：通过差异分析及相关性分析，得到上调基因60个，下调基因304个，相关DEGs 223个(图1A)。结合患者中位生存时间和生存状态，进行多基因的COX回归分析，得到与患者预后相关的DEGs 20个。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析发现，20个DEGs主要富集对IL-1、TNF的应答和G蛋白偶联受体结合位点上以及干细胞黏附分子、趋

6、化因子信号通路上(图1B、1C)。2预后相关DEGs风险模型及验证：Lasso Cox回归分析筛选得到12个基因，分别为VTCN1、RXRG、HSD11B1、RELN、LCN6、MUC15、C1S、CLDN10、TRARG1、CCL18、SLC7A10、ZNF831，其中VTCN1、HSD11B1、C1S为高风险基因；Kaplan-Meier单变量分析结果显示，高风险基因与患者生存期短有关。根据回归系数得到患者的风险评分，并将患者分为高、低风险组，Kaplan-Meier法进行生存分析结果显示，两组患者生存期差异有统计学意义（P0.05），高风险组患者生存期明显缩短（图2A)。预测模型的ROC

7、曲线见图2A，AUC值为0.716，表明该模型可预测胰腺癌患者的预后（图2B）。将预测模型可视化为生存预测列线图（图2C)。讨论胰腺癌恶性程度高，预后差，了解其肿瘤免疫微环境，对疾病的干预和预后的判断具有重要意义。有证据表明，高CCL2水平与更具侵袭性的恶性肿瘤、更高的转移概率和更广泛的癌症预后相关。CCL2在聚集肿瘤相关巨噬细胞中发挥作用，促使胰腺癌细胞重新改变其代谢途径耐以生存，并使得胰腺癌细胞能够在缺氧的条件下增殖。本研究通过GO功能和KEGG通路富集分析发现，CCL2相关因子除了作用于常规趋化因子通路外，还聚集干细胞黏附、IL-1的免疫反应和G蛋白受体的结合，可能与肿瘤的浸润、远处转移

8、、逃离细胞免疫监视等方面有关。根据CCL2相关性因子及Lasso Cox回归分析筛选的12个建模基因中，ZNF831被报道富集于CD4+T细胞浸润，进而可能参与调控胰腺癌CD4+T细胞的基因表达；SLC7A10属于溶质载体家族，其过表达降低了ROS生成并增加了线粒体呼吸的能力，促使脂肪细胞肥大，促进肥胖和胰岛素抵抗，进而引起血糖的变化，使得胰腺癌的风险增加；而同样，作为趋化因子家族的CCL18也能促使肿瘤的转移；RXRG高表达会引起血脂的异常风险增加，而血脂和血糖的变化与胰腺癌有着密切关系。CCL2由于能够激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，阻碍T细胞增殖，伴随着持续的免疫抑制，通过促进髓源性抑制细胞（M-MDSCs）的免疫抑制能力，从而促使肿瘤生长和增殖。血浆CCL2水平的升高是大肠癌复发的预测生物标志物。趋化因子CCL2的表观遗传沉默抑制巨噬细胞浸润以促进肿瘤的发展。本研究结果显示，相比低风险组患者，高风险患者生存期明显缩短（P0.05)；ROC曲线示该模型可以预测胰腺癌患者的预后。该模型基于各类基因的总体表达量，更符合当今的