植株叶片三种酶的测定

1、试剂配置磷酸缓冲液：50m mol/L的PH 7.0的磷酸缓冲液。母液A： Na2HPO4 - 12 H2O:71.64g溶于1000去离子水中。母液B: NaH PO4 - 2 HO:31.21g溶于1000去离子水中。 22305mL母液A 和 195mL母液B 定容至2000mL磷酸缓冲液配置2份，一份做PBS，一份溶解20g PVP，作为1%提取液并保存到冰箱。M D A的测定：1. 10 %的三氯乙酸（TCA）：称取200gTCA用去离子水定容至2000mL.2. 0.6%的硫代巴比妥酸（TBA）：称取6 gTBA用1（N）的NaOH约100mL于水浴溶解，然后用10 %的三氯乙酸定

2、容至1000mL.C A T的测定：0.2mol/L的H2O2：吸取30%过氧化氢（H2O2）5.68mL，用磷酸缓冲液定容至250mL。S O D的测定：1 130m mol/L的甲硫氨酸（Met）：称取1.9399g 用PBS定容至100mL。750 umol/L 的 NBT:称取 0.0613g 用 PBS 定容至 100mL，避光 保存。100 umol/L的EDTA-Na2：先配十倍的，用时稀释。称取0.03721g 用 PBS 定容至 100mL。20 umol/L的核黄素：先配十倍的，用时稀释。称取0.0075g用PBS定容至100mL，避光保存。测定流程：将叶子放入研钵，先加2

3、 mL提取液，一勺石英砂，研磨一会再 加2 mL提取液，磨好后转入离心管并用2 mL提取液冲洗一并转入， 摇匀 在10000 rpm, 4 C,离心15min， 上清液转至10mL容 量瓶，用提取液定容。 取2 mL沸水浴煮10min，另取2 mL于 10mL容量瓶，提取液定容用于SOD的测定，剩余冰浴保存用于其 余测定。一 M D A的测定：酶液2 mL （2次重复）+ 0.6% TBA 2 mL （空 白用提取液代替酶液）沸水浴15min冰浴冷却在10000 rpm, 4 C,离心 15min分别于 532nm、600nm、450nm 测定 OD值。二 C A T的测定：空白为去离子水，测

4、定如下:管号S0煮死酶液S1 （新鲜酶液）S2 （新鲜酶液）酶液（mL）0.20.20.2PBS (mL)1.51.51.5去离子水（mL）111上述试管25C预热一段时间后，逐管加入0.3 mL 0.2mol/L的H2O2，立即计时，并迅速倒入石英比色皿，在240nm下测吸光度， 每隔1 min读数一次，共测定4 min .三S O D的测定：每天12个叶子，分三组测定，每组做一个空白， 两个重复。其中核黄素和NBT要用稀释好的，混合液依照下面比例配 置，注意混合液的遮光气温较低时核黄素等药品要每天用前预热，配好混合液何稀释的核黄素也要放50-60C预热，否则测定值很小。PBSMetNBTEDTA-Na2去离子水60mL12 mL12 mL12 mL8 mL加2.60 mL混合液到各试管，然后分别加100uL酶液到两重复，（空 白和对照用提取液），再加现配核黄素（遮光）0.3 mL到各管，迅 速将空白放入35 C水浴30min （黑暗条件）