备课素材：人工化学合成目的基因

1、人工化学合成目的基因基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工化学方法合成；（2）重组DNA分子的构建：是基因工程的核心步骤，包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是CaCl2处理形成感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录

2、出了mRNA分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。那么，人工化学合成的目的基因与酶切后的载体进行连接，如何处理目的基因的两侧？试题解析试题：回答与基因工程有关的问题：（1）经过研究发现2019-nCoV的S蛋白能够刺激人体产生相应抗体。若S蛋白基因序列已知，可采用 合成相应的DNA片段作为目的基因。为了能与酶切后的载体进行连接，需在目的基因的两侧添加合适的 。（2）用限制性核酸内切酶和DNA连接酶处理目的基因和载体，形成 。为了避免载体自连和目的基因接入方向错误，常利用 处理目的基因和载体。将目的基因导入经 处理的大肠杆

3、菌中，完成转化过程。经筛选及 后，诱导表达获得大量的S蛋白。若要从分子水平检测目的基因是否表达，常采用 方法。答案：（1）化学方法 限制性核酸内切酶的识别序列 （2）重组DNA分子 两种限制性核酸内切酶 CaCl2 扩增 抗原-抗体杂交解析：（1）经过研究发现2019-nCoV的S蛋白能够刺激人体产生相应抗体。获取目的基因的方法有多种，若已知基因中的核苷酸序列，则可以通过化学方法直接人工合成目的基因。在目的基因的两侧不一定有合适的限制酶的识别序列，为了能与酶切后的载体进行连接，需在目的基因的两侧添加合适的限制酶的识别序列，便于限制酶进行识别和切割。（2）用限制酶和DNA连接酶处理目的基因和运载

4、体，形成了基因表达载体。常利用两种限制性核酸内切酶处理目的基因和运载体，使它们两端的黏性末端不同，以防止自身环化和接入方向的错误。经过CaCl2处理的大肠杆菌更有利于基因表达载体的导入，完成转化后，经过筛选及扩增，通过诱导表达出大量的S蛋白。常采用抗原-抗体杂交的方法从分子水平检测目的基因是否表达，即检查目的基因是否翻译出蛋白质即可。基因工程的发展史1.基因工程诞生美国分子生物学家科恩多年来对原核生物的质粒、尤其是对抗药性质粒进行了比较深入的研究。在质粒的提取、结构与功能以及它的转化机理等方面，都进行了不少开创性的工作，并把细菌质粒作为载体应用于重组DNA技术。1974年，把金黄色萄葡球菌的质

5、粒（上面具有抗青霉素的基因）和大肠杆菌的质粒“组装”成“杂合质粒”，“送入”大肠杆菌体内，使这种大肠杆菌获得了对青霉素的抗药性，这说明，金黄色葡萄球菌质粒上的抗青霉素基因，由“杂合质粒”带到大肠杆菌体内了，更重要的是表明外来基因在大肠杆菌体内得到了表达。同年，他从非洲爪蟾的DNA上“裁剪”了一段与大肠杆菌的质粒“拼接”，获得成功，拼接后的质粒带着非洲爪蟾的基因进入大肠杆菌了，大肠杆菌即产生了非洲爪蟾的核糖体核糖核酸（rRNA）。两栖动物的基因能在细菌里发挥作用，也能在细菌里不断复制的事实告诉人们，基因工程完全可以不受生物种类的限制，而按照人类的意愿去拼接基因，创造新的生物，如创造缫丝的大肠杆菌

6、、制药的大肠杆菌等等。当科恩取得了成功后，他立即以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利，成为实施基因工程的第一人。2.人工化学合成基因和重组质粒1970年，印度血统的美籍学者科兰纳首次用化学方法人工合成了有77个核苷酸对的酵母丙氨酸的结构基因。1972年，巴梯摩尔、斯派戈尔曼、列捷尔等领导的实验室各自用反向转录酶合成了家兔和人的珠蛋白基因，这是首次合成的真核生物基因。1973年，科兰纳再次得手，他合成了具有126个核苷酸对的大肠杆菌酪氨酸转运RNA（tRNA）基因。为了使合成的基因能发挥作用，科兰纳等经过三年埋头苦干，在1976年8月，终于使大肠杆菌酪氨酸

7、转运RNA（tRNA）基因顺利地转录出酪氨酸tRNA。1977年，美国加利福尼亚大学的博耶，用化学方法合成了人生长激素抑制因子的基因。人生长激素抑制因子是人脑、肠管、胰腺中分泌出来的一种神经激素，它能抑制甲状腺刺激激素，促胃液素、胰岛素和胰高血糖素的分泌，对肢端肥大症、急性胰腺炎和糖尿病等多种疾病都有医疗价值。之后，博耶将这个人工合成的基因与大肠杆菌质粒重组，重组DNA在质粒运载下顺利地进入大肠杆菌，这个人工合成的基因在大肠杆菌中为博耶制造出5毫克人的生长激素抑制因子。这5毫克生长激素抑制因子可以说是人造基因献给博耶的厚礼。如果用传统的办法从绵羊中提取5毫克生长激素抑制因子，那就要有50万个绵

8、羊脑袋。人工化学合成基因随着DNA合成技术的发展，特别是自动化合成技术的引入，人们能简便、快速、高效地合成其感兴趣的DNA片段。目前，DNA合成技术已成为分子生物学研究必不可少的手段，并且已在基因工程、临床诊断和治疗、法医学等各个领域中日益发挥重要的作用。1.人工合成基因目前有许多基因和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列已得到阐明，人们已经可以根据需要合成出具有实际应用和研究价值的多肽和蛋白质基因。已报道的合成基因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素2等，这些基因均已被克隆，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。目前，合成基因的方式有2种。（1）全基因合成：一般对于分子较小而又不易得

9、到的基因采用该方式。可将双链基因分成若干寡核苷酸单链片段(尤其待合成基因在100个核苷酸以上时)，每个片段长度控制在4060个碱基。在体外将除基因两端末端外的所有片段磷酸化。混合退火后加入DNA连接酶，即可得到较大的基因片段。采用分步连接、亚克隆的方法时，为便于亚克隆中回收基因片段。应在片段两侧设计合适的酶切位点，由于每个亚克隆可以分别鉴定，从而可减少顺序错误的可能性。（2）酶促合成：此法又称基因的半合成。全基因，特别是较大的基因的全部化学合成成本昂贵，使用半合成的方法可以降低成本，从而利于普及使用。首先合成末端之间有1014个互补碱基的寡核苷酸片段，退火后以重叠区作为引物，在4种dNTP存在的条件下，通过DNA聚合酶或反转录酶的作用，获得两条完整的互补双链。在合成基因的结构中，应包括有克隆和表达所需要的全部信号及DNA顺序，基因密码的阅读框架也应该同表达体系相适应。此外，由于不同种类的生物体或密码子的使用都具有明显的选择性，在基因合成和克隆时必须考虑这个问题。选择合适的密码子，以获得高效表达。2.合成连接子和接头在DNA重组中常需要将外源DNA片段插入某些载体DNA中。如果载体或外源DNA上没有合适的限制性内切酶位点，为提高插入效率或实现定向克隆，可采用合成连接子和接头的方法。使用连接子和接头需要插入片段是平末端，否则，首先