二章菌种选育保藏与复壮

1、二章菌种选育保藏与复壮二章菌种选育保藏与复壮 第二章 菌种选育、保藏与复壮 第一节 工业常用微生物及要求一、常见微生物 （一）细菌（bacteria）醋酸杆菌属（Acetobacter）乳杆菌属（Lactobacillus）芽孢杆菌属（Bacillus）短杆菌属（Brevibacterium）棒杆菌属（Corynebacterium）第2页，共58页幻灯片。 第二章 菌种选育、保藏与复壮第2页，共58页幻灯片。（二）放线菌（actinomyces）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）链霉菌（Streptomyces）小单孢菌属（Micromonospora）第3页，共58页

2、幻灯片。（二）放线菌（actinomyces）第3页，共58页幻灯片 （三）霉菌（mould） 1.曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger） 米曲霉（A. oryzae） 黄曲霉（A. flavus） 2.青霉属（Penicillum） 桔青霉（P. citrinum）第4页，共58页幻灯片。 （三）霉菌（mould）第4页，共58页幻灯片。3. 根霉属（Rhizopus ） 米根霉（R. oryzae） 华根霉（R. chinensis）4. 红曲霉属（Monascus）第5页，共58页幻灯片。3. 根霉属（Rhizopus ）第5页，共58页幻灯片。（四）酵母（yeas

3、t）酵母属（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2. 假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis）3. 毕赤酵母属（Pichia）第6页，共58页幻灯片。（四）酵母（yeast）第6页，共58页幻灯片。（五）其它微生物1.担子菌（basidiomycetes）即菇类（mushroom）2. 藻类（alga）第7页，共58页幻灯片。（五）其它微生物第7页，共58页幻灯片。几种菌落第8页，共58页幻灯片。几种菌落第8页，共58页幻灯片。 （六）噬菌体（phage） 危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。第9页，共

4、58页幻灯片。 （六）噬菌体（phage）第9页，共58页幻灯片。烈性噬菌体 引起寄主细胞迅速裂解。 受感染的细菌称敏感性细菌。温和噬菌体 随寄主细胞的繁殖而繁殖。 含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。第10页，共58页幻灯片。烈性噬菌体第10页，共58页幻灯片。 二、微生物工业对菌种的要求1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。2.易控制培养条件，发酵周期较短。3.抗杂菌和噬菌体的能力强。4.不易变异和退化，不产生任何有害物质和 毒素。第11页，共58页幻灯片。 二、微生物工业对菌种的要求第11页，共58页幻灯片。 第二节 工业微生物菌种的选育一、自然选育 1.采样 2.增殖培养 方法： （1）

5、控制培养基成分 （2）控制培养条件 （3）抑制不需要的菌类第12页，共58页幻灯片。 第二节 工业微生物菌种的选育第12页，共58页幻灯片。3. 纯种分离（1）划线法：简单、快捷。 （2）稀释法：菌落单一均匀。是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。第13页，共58页幻灯片。3. 纯种分离是指把混杂在

6、一起的微生物或同一微生物群体中的不固体培养基四区划法接种法第14页，共58页幻灯片。固体培养基四区划法接种法第14页，共58页幻灯片。接种针先以火焰灭菌法灭菌 步骤一第15页，共58页幻灯片。接种针先以火焰灭菌法灭菌 步骤一第15页，共58页幻灯片。轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却 步骤二第16页，共58页幻灯片。轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却 步骤二第16页，共58页幻灯以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。 步骤三第17页，共58页幻灯片。以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。 步骤三第17页，共5更换一个新的无菌营养平板 步骤四第18页，共58页幻灯片。更换一个新的无菌营养平板 步骤四第1

7、8页，共58页幻灯片。将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区 。步骤五第19页，共58页幻灯片。将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区 。步骤重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤六第20页，共58页幻灯片。重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。步骤七第21页，共58页幻灯片。由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。步骤七第21页，共重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。 步骤八第22页，共58页幻灯片。重复第六以及第七步骤，由第七步骤的步骤八第

8、22页，共58页幻重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。步骤九第23页，共58页幻灯片。重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩 在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。步骤十第24页，共58页幻灯片。 在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌固体培养基的稀释涂抹接种法第25页，共58页幻灯片。固体培养基的稀释涂抹接种法第25页，共58页幻灯片。需要使用的仪器震荡机 第26页，共58页幻灯片。需要使用的仪器震荡机 第26页，共58页幻灯片。吸取准备好欲稀释的菌液第27页

9、，共58页幻灯片。吸取准备好欲稀释的菌液第27页，共58页幻灯片。吸取充分均匀后的菌液 第28页，共58页幻灯片。吸取充分均匀后的菌液 第28页，共58页幻灯片。取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。第29页，共58页幻灯片。取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。第29页，共5将试管于震荡机上，使菌液混合均匀 第30页，共58页幻灯片。将试管于震荡机上，使菌液混合均匀 第30页，共58页幻灯片。取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL，加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。 第31页，共58页幻灯片。取出试管

10、中的第一次十倍稀释菌液1mL，第31页，共58页幻灯从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内。第32页，共58页幻灯片。从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内将三角玻璃棒浸于酒精中 第33页，共58页幻灯片。将三角玻璃棒浸于酒精中 第33页，共58页幻灯片。 将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧） 第34页，共58页幻灯片。 将三角玻璃棒在火焰上燃烧第34页，共5 使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。 第35页，共58页幻灯片。 使用玻璃棒将菌液均匀涂布

11、开来，将培养皿置于恒温培养箱第36页，共58页幻灯片。第36页，共58页幻灯片。4. 生产性能的测定 一般采用两步法： 初筛：以量为主 复筛：以质为主第37页，共58页幻灯片。4. 生产性能的测定第37页，共58页幻灯片。 二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍第38页，共58页幻灯片。 二、诱变育种诱变剂物理：紫外线，快中子化学：硫酸二 诱变育种的主要环节（1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液 诱变（2）用合适的方法淘汰负效应变异株， 选出性能优良的正变异株筛选第39页，共58页幻灯片。 诱

12、变育种的主要环节第39页，共58页幻灯片。 第三节 生产菌种的改良 一、原生质体融合（protoplast fusion） 1.标记菌株的筛选 2.原生质体的制备 3.原生质体的融合与再生 聚乙二醇（PEG）脱水剂 助融剂 Ca2+提高融合频率 4.融合子的选择原生质体，它是细胞进行各类代谢的主要场所，是细胞中重要的部分。原生质体可分为质膜、细胞器、胞基质三部分第40页，共58页幻灯片。 第三节 生产菌种的改良原生质体，它是细胞进行各第41页，共58页幻灯片。第41页，共58页幻灯片。 二、DNA重组技术（DNA recombination technology）目标DNA片断的获得与载体DN

13、A分子的连接重组DNA分子引入宿主细胞从中选出所需重组DNA分子的宿主细胞第42页，共58页幻灯片。 二、DNA重组技术第42页，共58页幻灯片。 第四节 菌种的衰退、复壮与保藏一、菌种的衰退 衰退的原因：1.菌种保藏不当2.菌种生长条件没有得到满足第43页，共58页幻灯片。 第四节 菌种的衰退、复壮与保藏第43页，共58页幻灯片。二、 菌种的复壮 1. 纯种分离 2. 通过寄主体进行复壮 3. 淘汰已衰退的个体第44页，共58页幻灯片。二、 菌种的复壮第44页，共58页幻灯片。三、菌种保藏 1.原理 低温、干燥、缺氧、缺营养物质 2. 方法 （1）斜面保藏法 （2）干燥保藏法 （3）悬液保藏

14、法 （4）冷冻干燥保藏法 （5）低温保藏法第45页，共58页幻灯片。三、菌种保藏第45页，共58页幻灯片。 第五节 种子的扩大培养一、微生物的培养方法 1.表面培养 2.固体培养 3.液体深层培养第46页，共58页幻灯片。 第五节 种子的扩大培养第46页，共58页幻灯片。第47页，共58页幻灯片。第47页，共58页幻灯片。二、菌种的扩大培养 菌种扩大培养的目的： 为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。 第48页，共58页幻灯片。二、菌种的扩大培养第48页，共58页幻灯片。 （一）种子制备的工艺流程 摇瓶保藏菌种 试管斜面活化 茄瓶斜面 种子罐 固体培养基第49页，共58页幻灯片。 （

15、一）种子制备的工艺流程第49页，共58页幻灯片。第50页，共58页幻灯片。第50页，共58页幻灯片。第51页，共58页幻灯片。第51页，共58页幻灯片。摇瓶种子培养发酵培养第52页，共58页幻灯片。摇瓶种子培养发酵培养第52页，共58页幻灯片。第53页，共58页幻灯片。第53页，共58页幻灯片。第54页，共58页幻灯片。第54页，共58页幻灯片。（二） 斜面菌种的培养 1.不宜多次移种。 2.活化斜面中加0.1%葡萄糖。 培养基特点：原料较精细。第55页，共58页幻灯片。（二） 斜面菌种的培养第55页，共58页幻灯片。（三）一级种子培养（摇瓶）培养基特点： 使用的原料基本接近于发酵培养基。第56页，共58页幻灯片。（三）一级种子培养