食品安全国家标准 食品中诺如病毒检测

1、PAGE 4PAGE 4食品安全国家标准食品微生物学检验 食品中诺如病毒检测1 范围 本标准本标准规定了食品中诺如病毒的测定方法。 本标准适用于食品中诺如病毒总数的测定。2 术语和定义2.1 实时荧光RT-PCR real-time fluorescence在普通RT-PCR的基础上加了一条特殊性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现

2、了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2.2 C值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1无菌平皿，直径90mm；3.2无菌手术剪；3.3无菌镊子；3.4无菌50ml离心管，耐氯仿，可高速离心；3.5无菌85ml离心管，耐氯仿，可高速离心；3.6无菌胶头滴管；3.7无菌移液管，10ml；3.8移液枪，1-1000ul；3.9匀浆机；3.10超净工作台；3.11天平，精密度为0.01g；3.12高速冷冻离心机，10000g；3.13恒温摇床；3.14荧光定量PCR仪。4

3、试剂4.1 含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液，配制方法见A.1；4.2 PEG8000，配制方法见A.2；4.3 病毒RNA提取试剂盒；4.4 Nuclisens裂解液；4.5逆转录试剂盒；4.6荧光PCR定量试剂盒；4.7 缓冲液1TAE，配制方法见A.3；4.8溴化乙锭（EB）溶液10ug/uL，配制方法见A.4；4.9琼脂糖凝胶，配制方法见A.5。5 检验程序无菌操作，取食品5g，加入25ml缓冲溶液匀浆37孵育30min或室温震荡30min，离心取上清，加10ml氯仿，震荡，离心取上清，加入等体积PEG8000，混匀冰上放置1h，离心，弃上清，用2ml Nuclisens裂解

4、液溶解沉淀使用QIAGEN试剂盒提取病毒RNA使用诺沃克病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针），定量检测诺沃克病毒6 操作步骤6.1诺如病毒的富集6.1.1在无菌平皿中进行无菌取样，取食品5g，加入25ml含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液，匀浆3min，为避免匀浆过程产生的高温破坏病毒，分两次匀浆，中间停顿1min。6.1.2将均质液转移到50ml离心管中，恒温摇床37孵育30min或室温震荡30min，4，10000g离心30min。6.1.3取上清，转移到另外的离心管中，加入10ml氯仿，充分震荡，放置10min，中间震荡一次，4，10000g离心30min。6.1.4取上清液2

5、5ml转移到85ml离心管中，加入等体积的PEG8000溶液（PEG的终浓度为8%），充分震荡混匀。6.1.5在冰上放置至少1h，4，10000g离心5min，弃上清，加入2mlNuclisens裂解液溶解沉淀，如不马上进行检测，将沉淀用1ml无菌水重悬，-70保存，避免反复冻融。6.2诺如病毒RNA提取使用商品化的病毒RNA提取试剂盒提取和纯化，步骤参考说明书，提取完成后，为XXRNA保存时间可选择性加入RNase抑制剂，操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套，并经常更换。6.3实时荧光RT-PCR以诺如病毒RNA作为阳性阳性对照，以不含诺如病毒的样品RNA作为阴性对照，以水代替模板作为空白对

6、照，每个体系设置两个平行反应.可根据具体情况调整总体积。6.3.1 实时荧光RT-PCR反应体系实时荧光RT-PCR反应体系见表1表1 实时荧光RT-PCR反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/uLGGRT-PCR缓冲溶液10155MgSO25mmol/L1 mmol/L22dNTPs10 mmol/L0.2 mmol/L11上游引物20umol/L1 umol/L2.52.5下游引物20umol/L1 umol/L2.52.5RNase抑制剂40U/uL0.8 U/uL11逆转录酶5 U/uL0.1 U/uL11DNA聚合酶5 U/uL0.1 U/uL11探针5umol/L0.1 umol/L

7、探针a:3探针b:11RNA模板1010水（无RNase）2023总体积50506.3.2实时荧光RT-PCR检测所用引物和探针实时荧光RT-PCR检测所用引物和探针见表2表2 实时荧光RT-PCR检测所用引物和探针检测的病毒类群引物序列（5-3）扩增片段长度G上游引物Cog 1F:CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA下游引物Cog 1R:CTT AGA CGC CAT CAT TYA C探针 RING1（a）-TP：FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-TAMRA探针 RING1（b）-TP：FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA

8、- TAMRA107bpG上游引物Cog 2F：CAR GAR BCN ATG TTY GRT GGA TGA G下游引物Cog 2R：TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA探针 RING-TP：FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-TAMRA119bp6.3.3荧光反应条件4845min；502min；9510min；9515S，561min，45个循环。7 结果判定实时荧光RT-PCR结果判定标准待测样品值Ct值大于或等于45时，则判定诺如病毒阴性；待测样品值Ct值小于或等于30时，则判定诺如病毒阳性；待测样品值Ct值小于45而大于30时，应重新进行

9、测试，如果重测样品的Ct值大于或等于45，则判定诺如病毒阴性，如果重测样品值Ct值小于45时，则判定诺如病毒阳性。 PAGE 105附_录A培养基和试剂A.1 甘氨酸缓冲液A.1.1成分甘氨酸（优级纯） 7.50g氯化钠（NaCl） 17.55g双蒸水 800ml5mol/L氢氧化钠溶液 pH9.5A.1.2制法加双蒸水至1000ml，高压蒸汽灭菌，121，20min。A.2 PEG8000A.2.1成分PEG8000（优级纯） 80g氯化钠（NaCl） 15.34gA.2.2制法加双蒸水至500ml，于磁力搅拌器上混匀后，高压蒸汽灭菌，121，20min。A.3 缓冲液1TAE（0.5mol/L EDTA-Na，乙二铵四乙酸二钠，pH8.0）A.3.1成分EDTA-Na2HO 186.1g双蒸水 800ml5mol/L氢氧化钠溶液 pH8.0A.3.2制法双蒸水加至1000ml，高压灭菌，121，20min。A.4 溴化乙锭（EB）10ug/uLA.4.1成分溴化乙锭 20mg灭菌双蒸水 20mLA.4.2制法将20mg溴化乙锭加入到20ml灭菌双蒸水中，混