基因组DNA的提取及实验方法

1、3)基因组DNA的提取采用SDS法，具体步骤如下：称取2-4克(油菜)叶片，放入研钵中，加液氮后充分研磨。转入20ml(约样品的一倍体积)DNA提取液中，混匀,65C水浴振荡(301-501rpm)1h左右。取出冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液，充分混匀后，置摇床上轻摇一小时。室温振荡1h左右使之完全混合。室温3000rpm离心30min。取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20C静置1h后，使DNA沉淀。钩出DNA，于70%酒精中漂洗2-3次。挑出DNA，用DNA真空干燥机真空干燥后，溶于适量TE(pH=8.0)中。DNA纯化：加入适量10mg/mlRNase,置37o

2、C30min，充分降解RNA。再用氯仿-异戊醇抽提一次，DNA沉淀、干燥、溶解程序同上。取适量DNA稀释液与标准浓度久DNA同时在1%琼脂糖凝胶电泳上进行DNA定量并检查DNA质量。附：(1)DNA提取液(1000ml)TOC o 1-5 h z1MTris-HCl(PH8.0)100ml0.5MEDTANa2(PH8.0)100ml5MNaCl100ml20%SDS62mlNaBisufite(CodaS-9000)3.8gddH2O637.5ml即配即用，充分混匀后调节pH至8.0。(2)50 xTE(100ml)Tris-HCl242g冰醋酸57.1ml加水至1000ml，灭菌。Tris

3、-HClpH=8.01M1000mlTris碱14.1gH2O800ml浓HCl49mlEDTANa218.6g混匀充分溶解后，调整pH至8.0,灭菌。模板(基因组DNA)1pl(10ng/pl)Primer(R)0.2pl(10uM)Primer(F)0.2pl(10uM)10 xbuffer1卩1dNTP(2.5mM)0.8plMgCl2(25mM)0.8plTaq酶0.1pl(0.5U)ddH2O25.9pl10plPCR反应在10训体系中进行PCR扩增产物中加入琼脂糖凝胶电泳专用的加样缓冲液2卩1,混匀，取4卩1PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为120V,电泳1

4、h左右，UV检测扩增产物的多态性。PCR扩增条件3min30Sec50Sec1min10min保存94C94CX(按所用引物确定退火温度)72C72C4C种子贮藏蛋白质样品的提取按Hurkman和Tanaka(1986)的苯酚为基准的总蛋白样品提取方法，并有所改进。将0.5g成熟种子在液氮中研磨成粉末状，分别加入提取液10mL50%(v/v)苯酚,0.45M蔗糖,5mMEDTANa2,0.2%(v/v)0巯基乙醇,50mMTris-HCl，pH8.8，充分混匀后将装有匀浆液的离心管在4C条件下，摇床上振荡30min，然后4C5000g离心15min，吸取上清液至新一离心管中加入5倍体积的-20

5、C的0.1M乙酸铵(0.7708g乙酸铵溶解在无水的100mL甲醇中)，-20C冰箱静置沉淀16h或过夜。第二天4C5000g离心10min，沉淀的蛋白用0.1M乙酸铵洗涤2次，再用冰冻的80%的丙酮洗1次，最后用70%的乙醇洗涤后，蛋白粉37C干燥后，放置-70C冰箱保存备用。（接下来要做SDS跑垂直胶）SDS电泳按Sambrook等（1989）的SDS程序，取适量种子总蛋白样品与2x样品缓冲液（100mmol/LTris-HCl，pH6.8，200mmol/LDTT，4%SDS，20%Glycerol，0.2%bromophenolblueR）混合，99C变性处理10min后,在8%的分离

6、胶和5%的浓缩胶组成的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。使用DYY212型电泳仪和DYCZ228C型垂直双板夹芯式电泳槽，电极缓冲液为十二烷基硫酸钠-甘氨酸（pH8.3）。每个样品点样15pl,室温下40V电压待指示剂到达分离胶与浓缩胶界面时，再调至100V稳压电泳，待指示剂迁移至凝胶底部后结束电泳。染色和脱色取下胶后，在染色液（1.0g考马斯亮蓝R250,450mL甲醇，100mL冰醋酸，450mL双蒸水）中染色30min，然后用脱色液（100mL甲醇，100mL冰醋酸，800mL双蒸水）脱色1d。Rf值及统计蛋白质亚基条带数参照刘敏轩等（2006）的方法，根据电泳结果计算每个实验材料蛋白带的Rf值

7、及统计蛋白质亚基条带数。蛋白质的相对迁移率Rf=蛋白带迁移距离/溴酚蓝迁移距离。记录样品中产生的多态性蛋白带，同一Rf值位置上有蛋白条带的记为1，无蛋白带记为0。输入计算机，用cluster软件统计分析，根据Main方法构建表征树。叶片全蛋白的提取一一三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法取油菜叶片3-4g放入预冷的研钵中加入液氮研磨成粉后（最好带上一次性手套，避免手直接接触叶片），加入3倍体积的蛋白提取液30mMTris-HCl（pH8.0）,0.1mMEDTA，6mM抗坏血酸，5mMMgCl2，1%PVP，0.02%0巯基乙醇，1%甘油，2%SDS，动作迅速并始终保持4C下混匀；转移至1.5ml离

8、心管中，4C15000rpm低温离心15min；将上清液转入另一离心管中，向管中加4体积的10%TCA溶液（10%三氯乙酸中加入0.02%卩-巯基乙醇，v/v）,混匀，-20C静置12h（或过夜，期间间歇一定时间振荡一次）；15000rpm离心15min,弃上清液，沉淀用80%冷丙酮洗涤三次，最后用冷丙酮-乙醚液（体积1:1）洗涤，沉淀经真空干燥得到粉末状蛋白，-80C冰箱保存备用。蛋白质的溶解称取1mg蛋白样品，在1.5ml离心管中加入350pl水化缓冲液（含7MUrea、2MThiourea、4%CHAPS、65mMDTT、0.2%Bio-ampholyte,pH310载体两性电解质、0.

9、001%溴酚兰），冰浴超声波裂解后，在4C、8000rpm离心2min,取上清液待测浓度。采用Bradford法测定样品溶液中蛋白质含量采用Ramagli改进的Bradford（1976）方法，考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。以蛋白质裂解液为空白,1mg/mlBAS标准蛋白（标准蛋白溶液用蛋白质裂解液配制）为标准制备标准曲线,在紫外可见分光光度计上于A

10、=595nm测定用三氯乙酸/丙酮沉淀法所获得油菜蛋白质样品的含量。溶液的配置Bradford储液:100mg考马斯亮兰G-250,50ml95%的乙醇，100ml85%的正磷酸，用水定容至1000ml，4C保存于棕色瓶中，可使用数周，使用前需要过滤。标准蛋白溶液：1mg/ml的BSA溶液：50mgBSA，用水定容至50ml，4C保存。标准曲线的制作取0,20,40,60,80，100pl不同体积的BSA标准蛋白质溶液（1mg/ml）于6支10ml小试管中，双蒸水调体积到100pl,再加入过滤后的5mlBradford储液，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，测量应在1小时内完成。

11、如表5.1所示。表5.1BSA标准曲线Table5.1StandardcurveofBSA管号TubeNo.BSA标准蛋白溶液(pl)BSAstandardproteinSolution(pl)ddH2O(pl)Doubledistilledwater(pl)Bradford储液(ml)Bradfordsolution(ml)吸光值(A595)Absorptionvalue(A595)101005-2208050.03353406050.0618460405023266100050.3275以不同浓度的BSA(mg)为横座标，测得的吸光值A595为纵座标作标准曲线，作

12、图得到一条标准曲线，根据标准曲线计算样品中蛋白质的含量。四：CTAB法对油菜基因组DNA的提取取油菜植株的新鲜幼嫩叶片组织lOOmg，液氮冷冻研磨成粉末；将粉末转移至预冷的2mlEppendorf离心管中，立即加入65C预热的2xCTAB提取液700pl，涡旋振荡混匀，65C温浴30min,期间轻轻颠倒混匀2-3次；混合物冷却至室温后，于4C，12,000rpm，离心5min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，室温放置10min；4C，12,000rpm，离心5min；重复步骤(4)(5)；取上清液，加入三倍体积的冰冻无水乙醇，轻轻颠倒混匀至DNA沉淀；4C，12,000r

13、pm，离心2min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次超净工作台上吹干；加入100plddH2O(内含20pg/mlRNase工作液)，过夜溶解沉淀并消化RNA。PCR反应在10皿体系中1pl(1Ong/pl)0.2pl(10pM)模板(基因组DNA)Primer(R)Primer(F)lOxbufferdNTP(2.5mM)MgCl2(25mM)Taq酶ddH2OH2Q总体积0.2pl(10pM)lpl0.8pl0.8pl0.1pl(0.5U)5.9plPCR扩增条件94C3min10pl30s50s1min10min94CX（按所用引物确定退火温度）72C72C4C保存PCR扩增产物中加入琼

14、脂糖凝胶电泳专用的加样缓冲液2pl,混匀，取4plPCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为120V,电泳1h左右，UV检测扩增产物的多态性。五：（黑色素）黑芝麻色素的测定结果一、黑芝麻色素的色价值测定：配制100mg/L的黑芝麻色素溶液，用0.5%NaOH完全溶解，浓度加大后溶解度降低,因此以0.5%NaOH做溶剂进行光谱扫描和色价测定，测定结果为在221nm有最大吸收峰，溶液稀释3倍后A值为0.435，但是吸收峰呈一个很平缓升高的坡形，峰不是很明显。0.5%NaOH测定pH在13左右。按照色价=吸光度值x1%/色素浓度（g/mL）的计算公式计算则色价为135。二、黑芝麻色素

15、的体外抗氧化作用评价：1、铁离子还原能力（总抗氧化能力）：05050011)值CPR图一黑芝麻总抗氧化能力与常用抗氧化剂BHT、BHA、Vc的比较2、清除DPPH自由基能力：浓度（mg/ml）图二黑芝麻清除DPPH自由基能力与常用抗氧化剂BHT、BHA、Vc的比较三、黑芝麻色素的光谱扫描的结果：1、0.5%氢氧化钠溶解的黑芝麻提取物紫外扫描图谱NOWavelength（nm）Abs1225.001.2182217.504.0003503.500.2054219.500.2705212.000.000nm.2、黑芝麻提取物水溶液紫外扫描图谱：取黑芝麻0.05g溶于10ml蒸馏水中，在4000转/分下离心lOmin取上清液，并于紫外分光光度计下扫描图谱。图谱如下：nrri.注:N