定量蛋白质组学研究技术

1、定量蛋白质组学研究技术定量蛋白质组学研究技术第1页细胞工程教研室定量蛋白质组学定量蛋白质组学是指把一个基因组表示全部蛋白质或一个复杂混合体系中目标蛋白质进行准确定量和判定。这一概念提出标志着蛋白质组技术不停改进和完善。蛋白质组学研究已从对蛋白质简单定性向准确定量方向发展。定量蛋白质组学研究技术第2页细胞工程教研室定量蛋白质组学研究技术第3页细胞工程教研室主要内容 定量技术体系与分类 荧光染料分析法 同位素标识技术 针对性亲和标签技术 同位素标识技术应用定量蛋白质组学研究技术第4页细胞工程教研室一 定量技术体系和分类 技术体系双向电泳-质谱技术体系蛋白质芯片分析体系基于同位素标识质谱分析技术体系

2、定量蛋白质组学研究技术第5页细胞工程教研室2-DE-MS技术体系无标识蛋白质双向电泳荧光差异凝胶电泳基于同位素标签和自动化串联质谱定量蛋白质组学研究技术第6页细胞工程教研室定量分析方法定性差异分析和定量差异分析绝对定量和相对定量凝胶差异分析和非凝胶差异分析标识定量法和无标识定量法定量蛋白质组学研究技术第7页细胞工程教研室二 荧光染料分析法双向电泳（2-DE）凝胶染料显示考马斯亮蓝银染荧光染色荧光标识定量蛋白质组学研究技术第8页细胞工程教研室 荧光双向差异凝胶电泳（2D-DIGE）当前，在传统2-DE技术基础上发展出2D-DIGE，采取专有荧光染料（Cy2、Cy3、Cy5）与多重样本和图象分析方

3、法，在同一块胶上可同时分离多个由不一样荧光标识样品，并以荧光标识样品混合物为内标，对每个蛋白质点和每个差异都能够进行统计学可信度分析，从而含有良好重复性和较高准确率。另外，因为荧光染料使用，使得2D-DIGE含有高灵敏度特征，能够满足高通量定量蛋白质组学研究分析要求。定量蛋白质组学研究技术第9页细胞工程教研室定量蛋白质组学研究技术第10页细胞工程教研室荧光扫描仪定量蛋白质组学研究技术第11页细胞工程教研室定量蛋白质组学研究技术第12页细胞工程教研室三 同位素标识技术原理 多肽和蛋白质质谱响应值受许多难以控制原因影响，尤其是其离子化效率受其它物质和条件影响很大，含有很强体系依赖性，因而不能对来自

4、相同肽段两次质谱检测得到信号强度像色谱定量中那样进行比较定量。定量蛋白质组学研究技术第13页细胞工程教研室一个肽惟一适合内标准是标识有稳定同位素同一个肽。所以，在完整蛋白或消化后多肽中引进稳定同位素（如2H、13C、15N、18O）标识小分子，用来识别不一样品起源肽段，经“轻”质和“重”质同位素标识不一样多肽相互作为内标，化学性质基础上是一样，这么就能够确保同一次质谱扫描中二者离子化效果是相同，此时肽质谱峰信号成对出现，质谱峰信号强度就能够作为定量依据。它们相对强度就准确地反应了原样品中多肽百分比（也就是蛋白百分比）。 定量蛋白质组学研究技术第14页细胞工程教研室 分类同位素标签引入方法生物代

5、谢方式化学方式酶解过程引入同位素标识引入法体内标识【代谢标识法（SILAC）】体外标识【化学标识法（ICAT）】定量蛋白质组学研究技术第15页细胞工程教研室 生物代谢方式引入标识原理 将一定量相同种类但表示水平不一样两个（细胞）样品分别置于正常培养介质和富含某重质同位素（如：15N）相同介质中培养，一定时间后将二者混合酶解，然后选择性亲和分离、色谱分离，并进行质谱分析。定量蛋白质组学研究技术第16页细胞工程教研室方法15N/14N蛋白质标识技术 分别用富含15N/14N细胞培养基培养要比较细胞或者简单生物体，经过生物代谢方式以15N替换氨基酸组成中14N，进而把15N标识引入蛋白质组成中。因为

6、氨基酸组成不固定（从甘氨酸1个到精氨酸4个），所以还没有把此标识用在细胞培养上报道。定量蛋白质组学研究技术第17页细胞工程教研室细胞培养条件下稳定同位素标签技术（SILAC） 经过细胞正常代谢，把稳定同位素标识氨基酸引入到蛋白质组成中，大大简化质谱定量分析前人工处理复杂度。可用在细胞培养条件下稳定同位素有： 2H、13C和15N等。定量蛋白质组学研究技术第18页细胞工程教研室定量蛋白质组学研究技术第19页细胞工程教研室 酶解过程引入标识18O/16O水 在两个要比较蛋白质样品酶解过程中分别加入18O和16O水，这么可特异性地对酶解肽段C末端进行标识，等量混合后进行质谱分析样品间蛋白质组差异。混

7、合样品须快速判定。酶解标识H218O 在H218O溶液中进行蛋白质酶解，可在其C端稳定结合1或2个18O原子。定量蛋白质组学研究技术第20页细胞工程教研室整体内标技术（GIST） 经过用N-acetoxy-2H3-succinimide/ N-acetoxy-succinimide(NAS)乙酰化处理酶解肽段，把同位素标签引入样本分析体系中。NAS可标识必需氨基酸亲和肽段N末端。因为肽段乙酰化位点不一，被标识重链和轻链质量差也不固定，给自动化分析带来了一定困难。定量蛋白质组学研究技术第21页细胞工程教研室亲和标签法引入标识原理 同位素标识亲和标签技术（ICAT）由Gygi等于1999年创造。此

8、技术是利用同位素亲和标签试剂，预先选择性地标识某一类蛋白质，分离纯化之后进行MS判定。依据MS图上不一样同位素标识亲和标签试剂标识一对肽段离子强度比值定量分析样品相对丰度。定量蛋白质组学研究技术第22页细胞工程教研室ICAT试剂组成：反应基团（特异性结合肽链中半胱氨酸残基巯基）连接子（结合稳定同位素）亲和标签生物素（可与卵白素结合，选择性分离标识多肽）定量蛋白质组学研究技术第23页细胞工程教研室操作流程同位素标识亲和标签轻试剂标识细胞蛋白质1同位素标识亲和标签重试剂标识细胞蛋白质2混合，胰酶水解阳离子交换卵白素亲和层析LC分离，MS分析，数据库检索定量蛋白质组学研究技术第24页细胞工程教研室优

9、点兼容任何生长条件下组织中蛋白质样品；烷基化反应高度特异；只分离含有半胱氨酸残基肽段，降低了体系复杂性；可对膜蛋白进行判定和定量；建立在色谱技术基础上，任何促进蛋白质溶解试剂都可使用；能直接判定和测量低丰度蛋白质。定量蛋白质组学研究技术第25页细胞工程教研室缺点无法分析不含半胱氨酸蛋白质；同位素标签存在影响肽段检测和增加数据库搜索复杂性；被标识含有两个半胱氨酸多肽质量相差16u时与氧化作用极难区分；样品成份复杂时，定量误差会增大标识效率含有时间依赖性，极难到达80%。定量蛋白质组学研究技术第26页细胞工程教研室应用测定和定量膜蛋白判定和定量低丰度蛋白质定量蛋白质组学研究技术第27页细胞工程教研

10、室 ICAT技术改进用13C/12C代替2H/1H，消除LC同位素效应固相同位素标识亲和标签可剪切同位素标识亲和标签（酸切 割或光切割）可裂解同位素标识亲和标签（cICAT）可视同位素标识亲和标签（VICAT）定量蛋白质组学研究技术第28页细胞工程教研室固相同位素标识亲和标签其是将ICAT试剂与玻璃珠结合，使之固相化，经过固相捕捉和释放等化学反应过程，LCMS-MS分析蛋白质肽段。该方法与传统ICAT方法相比，更简单，更灵敏，更有效。而最大不一样是固相ICAT试剂标识蛋白质是在酶解后进行，而ICAT试剂标识蛋白质要求在酶解前。固相同位素标签试剂由4个别组成，氨丙基包被玻璃珠、含有O-硝基苯光裂

11、解连接子、连接7个氢或7个氘亮氨酸同位素标签和巯基特异反应碘乙酰胺基团。定量蛋白质组学研究技术第29页细胞工程教研室可裂解同位素标识亲和标签用13C/12C代替了2H/1H使用了酸裂解连接子不一样肽段质量相差9u或9u倍数亲和标签试剂由3个别组成半胱氨酸特异性反应基团含9个同位素13C或12C标签可裂解连接子亲和纯化生物素定量蛋白质组学研究技术第30页细胞工程教研室可视同位素标识亲和标签是在cICAT技术基础上实现绝对定量改进方法。亲和标签试剂由3种不一样同位素标签组成。用来标识样品巯基标识标签（VICAT）标识内标多肽标签（14C-VICAT+6）等电聚焦标识标签（14C-VICAT-28）

12、定量蛋白质组学研究技术第31页细胞工程教研室定量蛋白质组学研究技术第32页细胞工程教研室同位素标识相对定量和绝对定量ICAT技术每次试验只能对两个样品进行相对定量。新近出现多重元素标识同位素标识相对和绝对定量技术（iTRAQ）在一定程度上处理了这一问题。它是年由ABI企业推出一个能够同时对四组样品进行定量分析方法，对于试验设计比较多组样品给予了有力支持。 定量蛋白质组学研究技术第33页细胞工程教研室iTRAQ试剂是非多聚体等质量标识试剂，是由四种试剂组成一组试剂，这四种试剂分子量相同。每一个试剂都包含三个别：一个汇报基团（分子量分别为114u、115u、116u和117u）、一个平衡基团（分子

13、量分别为31u、 30u、29u和28u）和一个与肽段反应基团。当咱们需要同时比较四组不一样品时，样品分别跟四种iTRAQ试剂结合，然后混合在一起做质谱判定。定量蛋白质组学研究技术第34页细胞工程教研室定量蛋白质组学研究技术第35页细胞工程教研室与ICAT试剂相比优点是通量大。iTRAQ试剂对氨基标识是一个普遍标识模式，它几乎全部肽段都能被标识。不过，假如用这种普遍标识方法来大规模判定和定量蛋白质(理论上说，每个蛋白质只要有一条肽段就能够对其进行判定和定量)，则是一件费时费劲事情。另外，在iTRAQ试剂标识需要反应体系有机相体积高达60以上，蛋白质样品很轻易发生沉淀而损失，这也是该试剂一个弱点

14、。定量蛋白质组学研究技术第36页细胞工程教研室四 针对性亲和标签技术 磷酸化蛋白质同位素标识亲和标签PHIAT技术是建立在ICAT技术基础上研究和判定磷酸化蛋白质磷酸化位点新方法，且对低丰度蛋白质判定有效。PHIAT试剂含有亲核巯基和同位素标签及其共价结合生物素基团。利用此方法已成功判定了酪蛋白和酵母提取物磷酸化位点。定量蛋白质组学研究技术第37页细胞工程教研室选择性标识特异性氨基酸同位素化学探针标识半胱氨酸标识色氨酸标识氨基酸N末端标识羧基标识定量蛋白质组学研究技术第38页细胞工程教研室非同位素化学探针标识 （Label-free LC MS/MS ）赖氨酸标识 质量丰度编码标签（MCAT）是一个色谱标识定量法。组氨酸标识 利用了固相金属亲和色谱可富集