流式细胞术实验方法及应用

1、流式细胞术实验方法及应用流式细胞术实验方法及应用第1页 科研型 分选功效488nm激光 四色荧光(525、575、610、675nm）流式细胞术实验方法及应用第2页 一、流式细胞术原理 流式细胞仪发展起源于细胞计数自动化研究。其原理是被荧光染色单细胞或颗粒，经过高速液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次经过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发产生不一样荧光信号，这些荧光信号能够反应细胞生物特征。流式细胞术实验方法及应用第3页前向散射激光流式细胞术实验方法及应用第4页FCM液流系统（怎样形成单个细胞流）样本管鞘液管流式细胞术实验方法及应用第5页 近30年来流式细胞术在我国得到很快发展，应用

2、范围不停增大。当前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。流式细胞术实验方法及应用第6页二、流式细胞术特点、优点速度快极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个细胞，甚至几万个细胞。多参数分析可同时分析单个细胞各种特征，取得单个细胞各种信息，也能够依据其细胞表面标志不一样把细胞群分为各亚群。流式细胞术实验方法及应用第7页定性、定量分析细胞经过荧光染色对单细胞一些成份，如：DNA、抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于10、G2/M15或S20、G2/M5流式细胞术

3、实验方法及应用第41页2、 淋巴细胞亚群分析白细胞分化抗原（CD分子）命名：1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将全部抗体依据白细胞分化抗原反应性类型划分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群(Cluster of Differentiation，CD)，进行编号、命名，即为单克隆抗体国际命名法。由CD抗体群识别分化抗原就称为CD分子。当前已经有339个分化抗体群被判定并命名流式细胞术实验方法及应用第42页 流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析标准方法。血液淋巴细胞是一群特异性极强细胞，依据淋巴细胞功效及膜表面标志，主要分为T淋巴细

4、胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)三个亚群。流式细胞术实验方法及应用第43页CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+ T淋巴细胞（CD3+）淋巴细胞 B淋巴细胞（CD19+） NK细胞（CD16+56）+流式细胞术实验方法及应用第44页NK细胞:CD(16+56)+/CD3-B淋巴细胞:CD19+/CD3-NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-流式细胞术实验方法及应用第45页外周血淋巴细胞亚群标识方法（表面标识） 50ul+10ul对应抗体 避光孵育15min 加Opt

5、iLyes C溶血素250ul 室温10min PBS洗一次 上机分析抗体: CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体CD19-PE/CD3-FITC二标抗体CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照流式细胞术实验方法及应用第46页淋巴细胞亚群检测临床意义： CD3+、CD4+、CD8+总数降低：细胞免疫功效低下 CD4+（CD4+/CD8+）降低或CD8+(CD8+/CD4+)升高：AIDS、病毒感染、恶性肿瘤（复发或转移）、再生障碍性贫血等 CD4+(CD4+/CD8+)升高或CD8+(CD8+/CD4+)

6、降低：本身 免疫性疾、多发性硬化病、本身免疫性溶血性贫血 CD3+CD4+CD8+T细胞降低：见于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、严重免疫缺点病。流式细胞术实验方法及应用第47页 NK CD(16+56) + 活性低下：肿瘤、白血病、本身免疫病、免疫缺点病等 NK+ CD(16+56) + 活性增高：多发性骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾病（B病毒、疱疹病毒、肺TB）、习惯性流产等 CD19+B细胞降低：体液免疫抑制 CD19+B细胞增高：B细胞恶性增殖性疾病（白血病）流式细胞术实验方法及应用第48页3、 白血病免疫分型 FCM作为白血病辅助诊疗，免疫分型是急白血病诊疗关键技术。利用不一样类型白

7、血病含有不一样抗原表示特异性进行分型：髓系、B淋巴系、T淋巴系、非系列特异性等。标识方法：往往需要胞浆和胞膜同时标识，一线抗体包含：胞浆（髓系-MPO，B淋巴系-CD79a, T淋巴系-cyCD3）,胞膜(髓系-CD13、CD117，B淋巴系-CD19、CD10, T淋巴系-CD3、CD2)等流式细胞术实验方法及应用第49页 采取CD45和侧向散射(SSC）设门技术可将各细胞群分开，荧光从强大到弱：淋巴细胞群单核细胞成熟粒细胞原/幼细胞(白血病细胞)，而成熟红细胞和血小板不表示。流式细胞术实验方法及应用第50页正常骨髓流式细胞分布图流式细胞术实验方法及应用第51页各系表示抗原造血干细胞：CD3

8、4、CD33髓系表示 ：CD13、CD14、CD33巨核细胞 ：CD61、CD41B细胞系：CD10 、CD19、CD20T细胞系：CD2、CD3、CD5、CD7NK细胞: CD16、CD56、CD57流式细胞术实验方法及应用第52页4、细胞因子检测 细胞因子（CK）主要由免疫细胞产生，也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等产生。一个细胞可产生各种CK，一个CK也可由各种细胞产生。细胞因子分为4类：白细胞介素（lL）；干扰素（IFN）；造血生长因子；肿瘤坏死因子（TNF）。流式细胞术实验方法及应用第53页血液中未活化白细胞内无或仅极小量细胞因子，当其被各种激活剂活化后，细胞内细胞因子合成增加

9、并不停分泌到细胞外而发挥作用。所以，要测定细胞内细胞因子较为困难。通常应用刺激剂（如：佛波脂）来刺激细胞因子分泌 ，同时加入一定浓度细胞内蛋白分泌抑制剂（如：莫能霉素），使细胞因子合成后累积在细胞内，经过细胞因子特异单克隆抗体进行细胞内荧光染色，并结合膜表面抗原染色，进行多色分析各种细胞内合成细胞因子。流式细胞术实验方法及应用第54页流式细胞术实验方法及应用第55页细胞因子检测（IFN-r ，IL-4）：全血或单细胞+刺激素(佛波脂)和阻断剂(莫能霉素) 37培养4-6h 加入细胞表面抗体(如CD3、CD4/CD8) 孵育20-30min PBS洗1次 加固定破膜剂 室温15min 加入IFN

10、- r和IL-4抗体 孵育30min PBS洗两次 FCM。流式细胞术实验方法及应用第56页结果分析：利用流式设门技术，先利用前向散射（FS）和侧向散射（SS）圈出淋巴细胞，再用CD3+和SSC设门圈出T淋巴细胞，再用CD8-/CD3+设门选定T淋巴细胞亚群，再分析IL-4+和CD4+/IFN-r淋巴细胞T淋巴细胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4流式细胞术实验方法及应用第57页5、细胞内Ca2+浓度Ca2+超载是细胞损伤主要标志，造成DNA降解，促使细胞凋亡。 检测 Fluo-3/Am是高特异性Ca2+荧光指示剂，能与Ca2+特异结合。Fluo-3它本身是亲水性，不易

11、透过膜，依赖其脂溶性AM（乙酰氧甲基），酯化后就轻易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶作用下，脱去AM重新生成亲水性形式，首先不能再进入细胞器，另首先易于在胞内扩散，与游离钙离子结合，经过检测其荧光强度可反应出细胞内游离Ca2+浓度改变。 单细胞悬液+flour-3/AM 37C避光孵育40min PBS洗1次 上机检测 流式细胞术实验方法及应用第58页6、线粒体膜电位 线粒体膜电位（MMP）是线粒体功效主要参数，是评价线粒体功效敏感指标，它大小直接反应线粒体功效及数量，MMP下降，其氧化磷酸化功效障碍，使ATP产生降低，造成细胞凋亡和坏死。流式细胞术实验方法及应用第59页MMP检测原理及方法：Rh

12、odamine123（罗丹明123）、DiOC6、JC-1等各种亲脂性阳离子荧光素都能被流式细胞分析用于作为检测 MMP探针。这些亲脂性荧光染料，对膜含有通透性，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，线粒体内膜内侧带负电荷，当它们与活细胞一起培养时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。 流式细胞术实验方法及应用第60页 当MMP降低后，线粒体内荧光素会发生外漏，在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强度能反应线粒体数量和MMP降低或丧失。操作：单细胞悬液（1*10 6 ）+1umol/LRh123 37 C,30min PBS洗两次 上机检测 流式细胞术实验

13、方法及应用第61页7、 FCM检测细胞凋亡 细胞凋亡是细胞在一定生理或病理条件下，遵照本身程序结束其生命过程。细胞凋亡为一个可调控、主动细胞死亡过程，有很多促进或抑制凋亡调控路径存在，因而就能够人为地诱导或抑制一些细胞凋亡，从而到达防病、治病目标。流式细胞术实验方法及应用第62页（1） Caspase家族 半胱氨酸蛋白酶（Caspase）以无活性酶原形式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性片段。活化Caspase深入激活其它Caspase前体，形成了级联放大切割过程，是直接造成凋亡细胞解体蛋白酶系统，当前已发觉15个Caspase家族组员，分别命名为Caspase1-15。在Caspase

14、家族组员中，Caspase-3是最主要指示蛋白酶。 流式细胞术实验方法及应用第63页操作：单细胞悬液（1*10 6） 固定和破膜剂 冰浴20min Perm/Wash Buffer洗两次 20ul单抗 室温孵育30min Perm/Wash Buffer洗1次 加0.5ml Perm/Wash Buffer 上机检测。流式细胞术实验方法及应用第64页（2） 凋亡相关基因蛋白细胞凋亡过程中有各种基因蛋白参加调控。凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、 ced基因家族等。 抗凋亡基因:bcl-2、bcl-XL、Bad 等 促凋亡基因:bax、bak、bcl-

15、XS等 染色标识同Caspase流式细胞术实验方法及应用第65页（3）Fas/FasL Fas又称APO-1，即CD95分子，是细胞膜上跨膜蛋白，表示在各种组织细胞，是经典细胞死亡受体。Fas/FasL是凋亡诱导家族主要组员之一，是调整组织发育和体内平衡主要分子,Fas/FasL结合,可向细胞传递死亡信号,引发细胞凋亡。 检测：同表面标识流式细胞术实验方法及应用第66页（4） 凋亡率检测被认为比较成熟方法：PI单染色法Annexin VPI双染法。TUNEL法流式细胞术实验方法及应用第67页碘化丙啶（PI）单染法（DNA周期分析）：因为凋亡细胞DNA被降解，小分子DNA可经过细胞膜渗透到细胞外

16、，另外凋亡小体也可带走个别DNA，造成凋亡细胞DNA含量降低，与荧光染料结合降低，荧光强度减弱，在DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现一个DNA含量降低亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。 流式细胞术实验方法及应用第68页流式细胞术实验方法及应用第69页流式细胞术实验方法及应用第70页Annexin VPI双染法：在凋亡细胞形态学改变中，胞膜改变是最早。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，组成早期凋亡主要生化特征，PS被特异Annexin V-FITC探针所标识，而PI对细活细胞和早期凋亡细胞是拒染，故Annexin V-FITC/PI双染法能区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。 流式细胞术实验方法及应用第71页机械损伤细胞： Annexin V -/PI+ 晚期凋亡、坏死细胞：Annexin V +/PI+早期凋亡细胞： Annexin V +/PI-活细胞： Annexin V -/PI-流式细胞术实验方法及应用第72页流式细胞术实验方法及应用第73页TUNEL法：细胞凋亡时，双链DNA会出现断裂点，即产生一系列3 端。