fish技术及其临床应用

1、fish技术及其临床应用fish技术及其临床应用第1页一、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH)60年代 Pardue Gall 建立（一）方法与原理：制备DNA探针（用生物素或荧光素标识）（下列图）变性制备CS或间期细胞标本变性处理探针与待测DNA杂交洗脱用荧光素标识生物素亲和蛋白使杂交区发荧光（信号放大）(下列图） 荧光显微镜检测2fish技术及其临床应用第2页（二）探针制备方法1.缺口平移法(Nick translatrion)用生物素（biotin)标识dUTPDNA酶切口DNApolymerase 53外切酶活性DNApolym

2、erase 53聚合酶活性3BdUTPfish技术及其临床应用第3页45335DNAse5335OHpDNA聚合酶标识核苷酸GGCOHOHOHOHpBBGCUAUA53355 33 5fish技术及其临床应用第4页分子杂交与信号放大5BBB荧光素亲和蛋白抗体探针待测基因CCGAGGCTGGCUCCGA(略）2.随机引物法（random primer):6聚核苷酸 klenow酶fish技术及其临床应用第5页6fish技术及其临床应用第6页FISH ProcedureDenature the chromosomesDenature the probeHybridizationFluorescen

3、ce stainingExamine slides or store in the dark7fish技术及其临床应用第7页（三）探针种类1）探针池探针（cs涂抹探针）：可结合在整条CS上每一部位。24色（常CS22条XY）8fish技术及其临床应用第8页9Whole chromosome probesfish技术及其临床应用第9页10Whole chromosome probes fish技术及其临床应用第10页11fish技术及其临床应用第11页2）着丝粒探针：结合于着丝粒处，检测间期核内DNA数（CS数）12fish技术及其临床应用第12页13fish技术及其临床应用第13页14Repe

4、titive sequence probesfish技术及其临床应用第14页3）端粒探针：结合于端粒处15fish技术及其临床应用第15页164) 特异位置探针 :cs某一详细位置探针 例：Yq12 repetitive probefish技术及其临床应用第16页17fish技术及其临床应用第17页18位点特异性探针fish技术及其临床应用第18页5）染色体臂涂抹探针：结合于csq或p上。19fish技术及其临床应用第19页（四）探针标识方法间接标识（前述） 时间长 信号显著直接标识 时间短 信号弱20fish技术及其临床应用第20页二、FISH种类： 以FISH过程中探针结合部位或探针颜色不

5、一样，将FISH分为各种。21fish技术及其临床应用第21页221.Centromere Single Color FISHfish技术及其临床应用第22页232.Single Color FISH (Telomeres)fish技术及其临床应用第23页243.Dual color FISHfish技术及其临床应用第24页254 多色荧光原位杂交fish技术及其临床应用第25页265.Spectral Karyotyping (SKY)（光谱核型分析）fish技术及其临床应用第26页276. 24 colors FISHfish技术及其临床应用第27页287.M-FISH with telo

6、meres and centromeresfish技术及其临床应用第28页29M-FISH with chromosome banding specific probesfish技术及其临床应用第29页308.间期FISHfish技术及其临床应用第30页三、 FISH优点（ Advantage）: less labor-intensive method for confirming the presence of a DNA segment within an entire genome than other conventional methods31fish技术及其临床应用第31页FISH

7、 - a process which vividly paints chromosomes or portions of chromosomes with fluorescent moleculesidentify the presence and location of a region of DNA within morphologically preserved chromosome preparations, then can identifies chromosomal abnormalitiesoften used during M phase but is now used on

8、 interphase as well32fish技术及其临床应用第32页四、FISH在医学中应用举例1、用已知探针检测未知CS畸变33fish技术及其临床应用第33页2、用显微切割方法检测未知CS畸变 显微切割PCR CS特异探针池(黄色荧光) 与正常人CS杂交(例:2号染色体某段发黄色荧光) 结果？34fish技术及其临床应用第34页3、产前诊疗 例:检测间期细胞内DNA分子数 例：21三体例：18三体35fish技术及其临床应用第35页4、植入前诊疗36Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD)fish技术及其临床应用第36页37图示1例13/14罗式

9、易位携带者胚胎植入前FISH诊疗资料：一对6年不育，女，32岁，cs正常，男34岁，核型：45，XY,t(13;14)(q10;q10),并伴少、弱精。采取单精子卵泡浆（intracytoplasmicsperm injection,ICSI)辅助授精，胚胎发育到3天6-8细胞期取出一个细胞进行双色FISH检测。参图：用13q和14q探针，见核中2个13号（绿色）和2个14号（红色）信号细胞，表明？fish技术及其临床应用第37页38移植后18周做羊水细胞CS检验fish技术及其临床应用第38页39PGDfish技术及其临床应用第39页5、肿瘤诊疗 肿瘤诊疗探针检测间期细胞内DNA分子数肿瘤细

10、胞内有癌基因扩增40fish技术及其临床应用第40页41肿瘤诊疗fish技术及其临床应用第41页42慢性粒细胞白血病fish技术及其临床应用第42页43慢性粒细胞白血病fish技术及其临床应用第43页44慢性粒细胞白血病fish技术及其临床应用第44页456.微小染色体畸变检测fish技术及其临床应用第45页46Microdeletion fish技术及其临床应用第46页7.遗传病诊疗 （图）例1：家系1 FISH结果用Xcs着丝粒探针（绿色）和DMD exon46探针(红色）杂交。图示DMD男患者FISH结果：只有Xcs着丝粒绿色信号，无DMD exon46红色信号，说明？47fish技术及

11、其临床应用第47页7.遗传病诊疗 （图）48 图示：DMD男患者姐姐2条Xcs都有DMD Exon46信号(红色）。表明？fish技术及其临床应用第48页7.遗传病诊疗 （图）49图示：DMD男患者妹妹只有1条Xcs上有DMD Exon46信号。表明？fish技术及其临床应用第49页7.遗传病诊疗 （图）50例2：家系2FISH结果在DMD患者母亲1/3淋巴细胞中仅有1条Xcs上有DMD Exon46杂交信号，另一条上无。fish技术及其临床应用第50页7.遗传病诊疗 （图）51图示：在DMD患者母亲2/3淋巴细胞中在2条Xcs上有DMDExon46杂交信号。A和B结果表明？fish技术及其临床应用第51页7.遗传病诊疗 （图）52例3：图示1复杂易位患者FISH结果（该患者致妻流产3次）核型：46，XY，t（5；20；16）(q35;p13;q21)三色FISH（5q绿色;16q橙色；20p蓝色）结果参图：a:5号;b:衍生5号;c:16号;d:衍生16号;e：20号;f：衍生20号.fish技术及其临床应用第52页53例4 FISH技术从母血中检测胎儿有核红细胞图示：孕早期母血中胎儿有核红细胞，可见YCS特异杂交信号。fish技术及其临床应用第53页54例5 13q