医学免疫学课件：标记免疫技术－基本概念

1、免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。（高度特异性） 标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。（如荧光素、放射性核素、酶、化学或生物发光剂等） 标记免疫技术：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原/抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。 (高度特异性和高度灵敏性的有机结合)标记免疫技术基本概念2免疫技术试剂标本AgAbAbAg3标记免疫技术试剂标本Ag*AbAb*Ag放射性核素荧光素酶化学发光剂胶体金标记物技术放射性核素放射免疫技术荧光素荧光免疫技术酶酶免疫技术化学发光剂化学发光免疫技术胶体金免疫金技术 标记免疫技术的分类： 免疫组化技术 总体 免疫测

2、定技术 按是否使用 放射性免疫测定 放射性核素 非放射性免疫测定 按测定反应体 均相免疫测定 固相免疫测定 系的物理状态 非均相免疫测定 液相免疫测定 放射免疫技术 酶免疫技术 按示踪物 荧光免疫技术 化学发光免疫技术 免疫金标记技术 三大经典的标记免疫技术荧光免疫技术 放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应与荧光技术相结合而建立的一种免疫标记技术，具有高度特异性、敏感性和直观性。荧光免疫技术是最早出现的免疫标记技术。经典的荧光免疫技术是以荧光素标记抗体对抗原进行定位染色，并借助荧光显微镜观察标本片上荧光染色形态，从而判断是否存在待测抗原-荧光抗体技术。然后才进一步发展出荧光免疫分

3、析技术，可对液体中的抗原、抗体进行自动化定量检测。7荧光抗体技术直接法 间接法 直接法:每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体间接法:敏感性比直接法高,制备一种荧光二抗可用于多种抗原的检测放射免疫技术始创于1959年Yalow和Berson用放射性核素标记胰岛素，常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。开创了体液微量物质定量分析的崭新领域，并为其他标记免疫分析的建立和发展奠定了基础。 但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足, 放免将逐渐被取代。9放射免疫测定法(RIA)示意图 Ag* Ab Ag 标记抗原 特异性抗体 待测抗原( Ag*-Ab)+

4、 (Ag-Ab) 抗原抗体复合物分离Ag*-Ab 和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和/或游离Ag*放射性 20世纪70年代初人们利用酶标记抗体或抗原作为主要试剂，创立了酶免疫分析，其后又衍生出酶免疫组织化学技术，两者统称为酶免疫技术。酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均 相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理均相酶免疫测定分类：液相酶免疫测定

5、 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物非均相酶免疫测定14酶联免疫吸附试验(ELISA)用酶标记Ab(或Ag)与标本中的Ag(或Ab)发生特异性结合加入酶的底物，在酶作用下产生有色物质,根据颜色可作出判断或测量光密度值+双抗体夹心法(检测抗原)均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝二对半”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、

6、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。化学发光免疫分析技术的类型化学发光酶免疫分析: 用酶标记抗原或抗体，免疫反应后，酶催化发光底物，引发发光。（直接）化学发光免疫分析: 化学发光物质直接标记抗原或抗体，免疫反应后引发化学发光。 电化学发光免疫分析： 电化学发光剂标记抗原或抗体，免疫反应后引发电化学发光。化学发光免疫分析技术的类型标记物底物原理检测信号均相/非均相推出年代碱性磷酸酶金刚烷LEIA光强度非均相19904

7、-MUPLEIA光强度非均相1992辣根过氧化物酶鲁米诺LEIA光强度非均相1989吖啶酯无CLIA光强度非均相1990三联吡啶钌无ECL电激发强度非均相199070年代中期，Arakaweu首次报道用发光信号进行酶免分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，将酶免疫分析和化学发光相结合； 1981年Pannagli等建立化学发光免疫分析（CLIA，chemiluminescence immunoassay）；1984年 Whitehead等首次在发光免疫分析系统中加入荧光素为发光增强剂，极大的提高了CLIA的敏感性；但当时这种方法也存在明显的不足，如：发光持续时间短，衰减快，仅为数秒，影响因素

8、多，故停留在实验室阶段。 进入90年代中期发展起全自动化学发光免疫分析仪，实现了分析自动化，加上CLIA的敏感性高（可达10-18mol）、快速、几秒钟内产生化学发光信号信息量大，持续时间长、可达数小时，而得到广泛的应用，从而成为非放射免疫分析中最有前途的方法。化学发光免疫分析作为一种非放射性免疫标记技术，除了具有灵敏、特异、标记物稳定、重复性好等特点外，还具有操作简便、快速、标本需要量少、可实现自动化等，因此，近年来检测范围不断扩大，临床上已应用于以下方面的检测：甲状腺激素、生殖激素、垂体激素和皮质激素、贫血因子、肿瘤标志物、感染性疾病、糖尿病如 胰岛素、血清C-肽、血浆胰高糖素等、心脏标志

9、物、病毒标记物、过敏性疾病、治疗药物监测等。免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)生物素-亲和素系统（BAS）是20世纪70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。生物素-亲和素系统具有高亲和力和多级放大效应，既能偶联抗原（或抗体）分子，又能偶联酶、荧光素等示踪物质，因此可桥联抗原抗体系统和示踪物质指示系统，赋予传统标记免疫分析更高的检测敏感度。BAS可应用于固相载体的包被环节，以实现某些抗原与固相载体的连接，并可减少抗体的空间位阻。荧光抗体技术、放射免疫分析和酶免疫技术-三大经典标记免疫技术。首先被用作标记免疫技术中的标记物是荧光素。1941年Coons建立的荧光抗体技术使组织和细胞中抗原物质的定位成为可能。放射性核素作为标记物在免疫技术中的应用又开创了特异性的超微量免疫测定。1956年Yalo