医学免疫学课件：流式细胞术在临床及科研中的应用

1、流式细胞术在临床及科研中的应用一、流式细胞仪工作原理二、荧光染料选择三、样本制备四、数据分析处理五、流式技术生命科学中的应用 流式细胞技术及工作原理在流动的状态中快速检测颗粒各种物理及生物特征的新型分析技术和分选技术；样品的液流技术 细胞分选和计数 数据采集和分析流式技术是综合高科技技术的结晶Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid流式细胞术能做什么？ 检测悬浮的各类细胞或微粒 动、植物细胞， 细菌，病毒 遗传物质（DNA,RNA)、 各种蛋白质或其他分子。 还可以研究塑料微球或其他悬浮于液体中的微粒。 区分“死”

2、、 “活”细胞 鉴别“生物样本”、与“非生物样本” 测定细胞或颗粒的散射光、染色荧光、自发荧光 细胞分选 流式细胞仪原理检测信号散射光信号前向散射光信号(FSC)：与激光束方向同轴的称前向角散射光信号侧向散射光信号(SSC)：与激光束垂直的称为侧向角散色光信号荧光信号流式细胞仪原理流式细胞仪原理前向角散射光信号（FSC）FSC反映细胞大小，一般来说，细胞越大，前向角散射光信号越强；FSC信号与细胞的折射率有关；可用于表示细胞的凋亡；区分死/活细胞时，可用于设门 流式细胞仪原理侧向角散射光信号（SSC）SSC信号主要反映了细胞的内部结构，内部结构越复杂，SSC信号越强；流式细胞仪原理流式细胞仪原

3、理特征荧光信号当荧光抗体或标记其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。 流式细胞仪原理激光光源波长: 488nm FITC PE, PE-CY5/PerCP 635nm APC影响因素：三稳定一确保 荧光实验条件稳定 正压光电系统稳定 液流系统稳定 确保单细胞悬液分散均匀，无过量杂质混入 样本制备 样本制备可检测的样本种类多样 外周血，骨髓、穿刺液，洗脱液，培养细胞 血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 实体组织等 样本制备细胞悬液制备 荧光标记 新鲜组织标本经胰酶消化制备单细胞悬液 溶血 Ficoll梯度

4、离心获得PBMC 细胞悬液浓度：106107/ml 活细胞的存活率90%肝、脾、淋巴节扁桃体等组织荧光染料的选择 荧光染料的选择每一种荧光染料有自己的激发波长和相应的发射波长选择荧光染料要考虑:流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料流式细胞仪配置的光学收集系统可否检测该荧光染料的发射波长同时使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰 荧光染料的选择488nm激光激发的染料 荧光染料的选择633nm激光激发的染料(APC)595 nm and 633 nm EXCITED DYES 荧光染料的选择UV激光激发的染料 荧光染料的选择常见荧光染料的发射波长 荧光染料的选择荧光染料的选择不同的荧光素

5、有不同的发射光强度；能否区分阳性与阴性，与选用何种荧光染料标记的抗体密切相关；高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光素（如PE和APC）标记的抗体检测； 荧光染料信号的“强弱”与所用的流式细胞仪也有关系，同一份样本在不同型号流式细胞上检测的结果会不同；这种差异主要是因为光学系统的不同； 荧光染料的选择非特异结合有些荧光标记的抗体表现出低水平的非特异结合，会造成阴性细胞的荧光水平升高。有些染料如（Cy3、Cy5和Cy5.5）和Texas Red直接标记的抗体，以及某些复合染料如ECD，与某些细胞亚群的结合性增强。 数据分析 数据分析数据显示：

6、单参数直方图 二维点图 二维等高图 假三维图及列表模式数据分析： 检测指标阳性百分率（%）绝对计数（个/ L ）平均荧光强度（MFI） 数据分析设门用来限定感兴趣的细胞群；FSC vs SSC点图是传统上用于设门的图；分析淋巴细胞群时，CD45 vs SSC点图设门更优于FSC vs SSC点图设门； 数据分析设门-确定要分析的目的细胞群Side ScatterForward Scatter0200400600800100002004006008001000R1 数据分析设门100101102103104SSC-HeightR1CD3-PE100101102103104100101102103

7、104Anti-HLA-DR FITCGated on R1100101102103104CD25-PE 数据分析对照样本 检测样本 数据分析直方图统计表 数据分析点图统计表对照样本检测样本流式细胞技术进展 多激光，多色分析 增加检测参数而不影响检测灵敏度， 新荧光染料的开发 紫外光激发的Pacific Blue，Alexa Fluora 405； 蓝光激发的Alexa Fluora 488； 红光激发的Alexa Fluora 647; 荧光耦连物，如PE-Cy5，APC-Cy7，PerCP-Cy5.5 等电子系统数字化 荧光间补偿的调整也更加简单,并可以脱机补偿 。流式细胞仪临床应用的新进

8、展 多色分析：提高了流式细胞分析的信息量绝对计数：单平台绝对计数方法荧光定量分析：可以判断细胞上抗原表达密度，细胞荧光强度越强，细胞抗原表达密度也越高微生物分析：直接对微生物颗粒进行分析，快速灵敏，尤其适合生长缓慢的微生物，如分支杆菌，一些霉菌等 荧光定量分析 （QFC)判断细胞上抗原表达密度，细胞荧光强度越强，细胞抗原表达密度也越高荧光定量分析可以有效区分弱表达与强表达。荧光定量分析可以消除不同仪器检测检测误差，使不同仪器间的结果具有较好的可比性。在细胞的发育分化过程或疾病进程中，细胞某一抗原可能持续表达，但其表达密度随细胞变化而改变，这时就需要进行细胞的荧光定量分析了。 流式细胞技术在生命

9、科学中的应用细胞表面抗原分子的测定细胞凋亡检测细胞因子测定（胞内、胞外）在肿瘤学方面的应用在血液学方面应用细胞分选淋巴细胞免疫分型T-细胞亚群（CD4/CD8/CD3） 早期活化T亚群（CD4/CD69/CD8） 活化T淋巴细胞（CD3/HLA-DR） 活化的T细胞亚群（CD4/CD25/CD8） 调节性T细胞: D4+CD25+/CD8+CD25+ B-淋巴细胞（CD3/CD19） B-淋巴亚群（CD19/CD5） NK细胞 （CD16/56)淋巴细胞亚群分析临床意义-机体免疫状态的评价通过对机体免疫状态的检测可了解在不同情况下体内免疫功能状态,探索疾病的发病机理、跟踪病程、判断预后，监测、

10、指导临床治疗方案。淋巴细胞亚群分析临床意义感染性疾病病毒性肝炎乙肝感染后,一方面通过体液免疫阻止病毒感染,减少病毒载量,另一方面细胞毒性T淋巴细胞在清除病毒和肝细胞破坏上起了双重的作用。一般CD8+百分比比增高。监测治疗：病毒的清理主要通过细胞因子,尤其是TNF和IFN.这一过程对肝细胞并不造成损害.判断预后：病人的预后有赖于病毒载量和机体免疫状态之间的平衡。淋巴细胞亚群分析临床意义感染性疾病ADIS T淋巴细胞总数减少 T细胞亚群（CD3+CD4+/CD3+CD8+）比例倒置，Th/Ts1.0 Th细胞(CD4+细胞)绝对计数10-15% DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性

11、肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 组织标本准备新鲜组织标本：机械法或胰酶消化制备单细胞悬液冰冻组织标本：组织复苏 机械法制备单细胞悬液石蜡组织标本： 脱腊：二甲苯浸泡石蜡组织切片脱石蜡（12天） 水化：梯度酒精到蒸馏水组织逐步水化 （每步10min) 消化：胃蛋白酶解聚分散组织细胞间的蛋白物质 （370C，30分钟 ） 过滤收集细胞：300目筛网 细胞凋亡检测流式细胞术检测凋亡的研究内容Annexin V细胞膜磷脂酰丝氨酸检测Caspases细胞酶的检测DNA 含量分析调亡相关蛋白：Fas、Bcl-2细胞凋亡Annexin ANNEXIN V标记检测凋亡凋亡细胞死亡细胞活细胞细胞凋亡DNA分析PI - Fluorescence# Events调亡细胞正常G0/G1期细胞 在血液学方面应用血小板检测网织RBC计数PNH检测干细胞检测骨髓CD34细胞绝对计数白血病免疫分型 白血病免疫分型正常骨髓表型 异常骨髓表型白血病与淋巴瘤的免疫分型 细胞功能检测膜电位检测Ca2+检测：胞内钙离子对调控细胞的多种代谢、信号转导起着至关重要的作用荧光染料