医学微生物学：第10章 非发酵革兰阴性杆菌

1、第十章 非发酵革兰阴性杆菌 尿标本涂片镜检痰标本涂片镜检痰标本涂片镜检痰标本涂片镜检掌握：铜绿假单胞菌、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌的形态和培养特征，种属鉴定。熟悉：非发酵菌的临床意义。了解：非发酵菌的分类。概 述非发酵菌概念：一大类不能以发酵形式利用葡萄糖的需氧、无芽胞革兰阴性杆菌的统称。 非发酵菌共性：不发酵葡萄糖，氧化或产碱型，氧化酶阳性，动力阳性。临床常见非发酵菌第一节 假单胞菌属 第二节 不动杆菌属 第三节 其他临床常见非发酵菌 一、窄食单胞菌属 二、伯克霍尔德菌属三、产碱杆菌属四、军团菌属 第一节 假 单 胞 菌 属 （Pseudomonas）分类属于假单胞菌科（Pseudomon

2、adaceae)与人类疾病有关的主要有11个种。代表菌为铜绿假单胞菌。P159自然界广泛存在，尤其在潮湿的环境。存在于生水果蔬菜、游泳池、隐形眼镜用液、美容剂等。消毒剂、软膏、透析液及设备、呼吸道治疗装置、沐浴喷头中存在。临床意义院内呼吸道感染的首要致病菌，尤其是ICU中插管患者。菌血症伤口感染泌尿道感染眼部感染耳部感染 形态和培养特征形态：杆菌染色性：革兰阴性排列：散在排列特殊结构： 有鞭毛 无芽胞 无荚膜形态和培养特征培养特征：专性需氧营养要求不高最适生长温度30和37最适pH7.0生长过程中产色素（水溶性）各种假单胞菌产生的色素细菌色素颜色铜绿假单胞菌荧光假单胞菌恶臭假单胞菌斯氏假单胞菌

3、洋葱伯克霍尔德菌腐败希瓦纳拉菌绿脓素、玉红脓素、绿脓荧光素荧光素荧光素未定名黄色素紫色素、未定名黄色素未定名色素黄绿色、红色、黄色黄绿色黄绿色黄色紫色、黄色淡红褐色非发酵菌科与其他科细菌的区别试验肠杆菌科弧菌科非发酵菌葡萄糖氧化酶形态鞭毛F-杆状周毛或无F+弧形单毛O/-+*杆状单、丛毛、周毛常见非发酵革兰阴性杆菌的初步分群鉴定试验假单胞菌属不动杆菌属产碱杆菌属黄杆菌属氧化酶葡萄糖发酵试验(O/F试验)动力+O/-+/-O/-+-+/-O+/-铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa简介广泛分布于自然界、土壤、水、空气中。人体皮肤、肠道、呼吸道均有存在，特别是儿童皮肤分离出该菌

4、达25%。条件致病菌，是医院感染的主要病原菌之一。临床意义在各种原因所致的人体抵抗力低下时引起皮肤感染、呼吸道感染、泌尿道感染、烧伤感染等。可导致菌血症、心内膜炎、囊性纤维变性。感染眼部的铜绿假单胞菌，可以合成胶原酶，以致引起角膜穿孔而失明。在假单胞菌属的感染中铜绿假单胞菌的感染占70%2009年铜绿假单胞菌的标本来源致病性铜绿假单胞菌有多种毒力因子，包括结构成分、毒素和酶：粘附素：菌毛多糖荚膜：抗吞噬内毒素：LPS外毒素绿脓素：催化产生有毒基团组织损伤弹性蛋白酶磷脂酶C培养特性专性需氧菌，部分菌株能在兼性厌氧条件下生长。营养要求不高，可生长的温度范围为2542，最适生长温度为2530，4 不

5、生长。普通平板上可生长血平板生长良好形态及培养特征可在麦康凯上生长形态及培养特征荧光组假单胞菌可产生青脓素（荧光素）铜绿假单胞菌产生的青脓素形态及培养特征铜绿假单胞菌在平板上可形成5种菌落： 典型型 大肠菌样型 粘液型 侏儒型 粗糙型粘液型侏儒型大肠菌样型典型型粗糙型The Colonies of Pseudomonas aeruginosa镜下形态铜绿假单胞菌鉴定特征革兰阴性杆菌，动力阳性（单鞭毛）特征性的菌落、色素、气味42可生长，4不生长氧化酶（+）、氧化分解葡萄糖乙酰胺水解（+）、还原硝酸盐生成氮气精氨酸双水解（+）生化特征氧化酶阳性触酶阳性生化特征氧化分解葡萄糖硝酸盐还原(产N2)（

6、）铜绿假单胞菌检验程序脑脊液、胸(腹)水、脓液、分泌物、痰、尿液、十二指肠引流液分离培养血琼脂平板1.肉浸汤2.胰化酪蛋白 大豆肉汤血液、环境用品直接涂片革兰染色粪便分离培养：SS、麦康凯37培养1824h挑选菌落鉴定 初步鉴定 菌落特征、色素、绿脓素：+涂片、革兰染色、氧化酶：+ 最后鉴定生化反应分型：血清学 噬菌体、绿脓素检验结果分析与报告结合临床感染症状，患者血、尿液及无菌体液中分离到铜绿假单胞菌，特别是反复检出即可确定是感染病原菌。最多见的是在抵抗力低下、长期住院患者出现的院内感染。如患者无感染的临床表现，虽然分离到革兰阴性杆菌亦应作为正常菌群，特别是儿童因为儿童正常皮肤带菌率高。铜绿

7、假单胞菌可以引起小儿类似沙门氏菌或霍乱样病的严重腹泻，所以诊断一定要与临床表现相结合。2009年铜绿假单胞菌的敏感耐药率铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌的耐药机制泛耐的铜绿假单胞泛耐：指对所有临床常用的抗生素均耐药。除氨基糖苷类(如阿米卡星)外，其余抗生素均耐药。耐药机制复杂。临床面临无药可用的局面。真正的“超级细菌”。青霉素结合蛋白（PBPs）的改变铜绿假单胞菌的PBPs结构发生改变后，内酰胺类抗生素与PBPs的亲合力下降，引起细菌对抗生素的敏感性降低。 外膜通透性的障碍 ：孔蛋白OprD2的缺失细菌对亚胺培南耐药。一般情况下，小分子水溶性药物可通过细胞膜的孔蛋白(具有运输、交换物质的作用)进入细菌

8、，但是铜绿假单胞菌缺乏这种典型的通道，导致其具有天然的多重耐药性。 主动外排(主动泵出)系统 (占主导地位)MexA-MexB-OprM：泵出除碳青霉烯类以外的大部分内酰胺类药物、四环素、氯霉素、氟喹诺酮类、大环内酯类药物 。MexC-MexD-OprJ：泵出第四代头孢菌素、四环素、氯霉素、新氟喹诺酮类、大环内酯类 。MexE-MexF-OprN：泵出碳青霉烯类抗生素(亚胺培南、美罗培南)、氯霉素、氟喹诺酮类 。MexX-MexY-OprM：泵出红霉素、氨基糖苷类、氟喹诺酮类抗菌药物 。生物膜(Biofilm) 由于存在大量的多糖包被(glycocalyx)，抗生素难于 穿透生物膜而作用于深层

9、的细菌，同时细菌细胞膜通透性降低，使药物对细菌的敏感性下降。 抗生素可诱导细菌产生内酰胺酶。 内层的细菌难于获取养分和氧气，生长代谢缓慢，对外界刺激(包括抗生素)不敏感。 喹诺酮类药物对铜绿假单胞菌生物膜有较强的穿透作用。大环内酯类药物如克拉霉素可显著减少多糖生成，与其它抗铜绿假单胞菌药物具有协同作用。 产内酰胺酶 AmpC酶(ClassC)A类超广谱内酰胺酶(ClassA) B类超广谱内酰胺酶(金属酶) D类超广谱内酰胺酶(ClassD) ETDA筛选金属酶(双纸片协同法)第二节 不动杆菌属 （Acinetobacter） 分类至少可分29个基因组其中至少17个已命名： 鲍曼不动杆菌（A b

10、aumanii） 醋酸钙不动杆菌（A calcoacelicus） 溶血性不动杆菌（A haemolyticus） 约翰逊不动杆菌（A johnonii） 洛菲不动杆菌（A lwoffii） 琼氏不动杆菌（A junii） 耐放射性不动杆菌（A radioresistens）临床意义能在潮湿和干燥表面生存条件致病多重耐药主要引起医院感染： 呼吸道感染 泌尿道感染 伤口感染鲍曼不动杆菌引起的感染鲍曼不动杆菌感染鲍曼不动杆菌肺炎 占VAP的510% 鲍曼不动杆菌血流感染ICU 患者死亡率35% 颅脑术后鲍曼不动杆菌脑膜炎死亡率可达70%湿热地区酗酒患者不动杆菌引起CAP死亡率约50%鲍曼不动杆菌引

11、起约2.1%的ICU内皮肤软组织感染伊拉克、阿富汗外伤创口培养中不动杆菌阳性率30%CID 2005; 41:848-54.CID 2004; 39:309-17.JAC 2007; 60:197-9.Chest 2006; 129:102-9.CID 2007; 45:409-15.伊拉克美军带回的鲍曼不动杆菌在美国流行http:/www.leishmaniasis.us/Mapping.html菌群变迁中山一院2011年第三季度鲍曼不动杆菌鲍曼不动杆菌全院外科2005-2010年 CHINET监测不动杆菌占革兰阴性菌比例形态和培养特征形态：球杆菌排列：常成双排列染色性： 革兰阴性（不易脱色

12、）特殊结构： 无鞭毛 无芽胞 粘液型菌株有荚膜 鲍曼不动杆菌革兰染色鲍曼不动杆菌扫描电镜培养特性： 专性需氧菌 一般营养要求不高 最适生长温度3537 鲍曼不动杆菌可在42 生 长，其他不动杆菌不生长。形态与培养特征鲍曼不动杆菌菌落（普平）血平板： 中等大小、圆形、灰白色、边缘整齐的菌落，一般不溶血（除溶血不动杆菌外）形态与培养特征形态与培养特征醋酸钙不动杆菌菌落（麦康凯48h）Mac平板： 无色半透明不发酵乳糖小菌落（溶血不动杆菌） 氧化分解乳糖菌落（鲍曼不动杆菌等）形态与培养特征鲍曼不动杆菌麦康凯上菌落洛菲不动杆菌麦康凯上菌落生化反应不发酵糖类氧化酶阴性硝酸盐还原试验阴性动力阴性触酶阳性氧

13、化乳糖(溶血不动杆菌除外)不动杆菌检验程序： 尿液、痰液、脓汁 直接涂片 分离培养 革兰染色 （血平板、麦康凯） 35 1824h 镜检 可疑菌落 涂片革兰染色 动力 KIA 全面生化反应 革兰阴性球杆菌 阴性 底层斜面 最终鉴定 氧化酶阴性 不变色 报告抗生素应用对于不动杆菌属，对全部氨基青霉素、一代二代头孢菌素和一代喹诺酮类抗生素天然耐。酶抑制剂舒巴坦对不动杆菌有一定的抑菌作用。天然携带的-内酰胺酶AmpC酶：基础的低水平表达对广谱头孢菌素的活性影响很小OXA-51型酶：处于基础低水平表达的菌株对所有-内酰胺类药物仍然敏感IS（ISAba1，IS1135 等）：增加染色体介导-内酰胺酶基因

14、表达，介导AmpC酶对头孢他啶、OXA-51为对碳青霉烯类抗生素耐药细胞膜天然的低通透性醋酸钙不动杆菌对头孢菌素的通透性比铜绿假单胞菌低2-7倍；碳青霉烯类、头孢菌素类抗生素在其外膜脂质中的扩散速率仅为大肠埃希菌的1-3；鲍曼不动杆菌极可能有类似的特性强大的耐药基因获得能力Acinetobacter baylyi ADP1拥有比大肠杆菌感受态细胞强大100倍的捕获外源DNA能力错配修复系统mutS 的缺失增加了部分不动杆菌的突变频率不动杆菌中的碳青霉烯酶D类碳青霉烯酶（OXA-23型）B类碳青霉烯酶(IMP、VIM型)A类碳青霉烯酶碳青霉烯类的使用是IR-MDRAB出现的唯一独立的高危因子Ye

15、 JJ, et al. PLoS One. 2010 Apr 1; 5(4):e9947IMP纸片EDTA2-巯基丙酸阳性对照株结果临床标本结果IMP纸片EDTA2-巯基丙酸产金属酶的鲍曼不动杆菌鲍曼不动杆菌外排泵近年来， AdeABC外排系统研究成为热点2013年鲍曼不动杆菌的耐药率%鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类的耐药率%变迁亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌对替加环素的MIC（微量肉汤稀释法）分布图2012年2013年美国Detroit鲍曼不动杆菌监测结果耐药性增加伴随着感染数上升！AAC, 2010：22352238XDRPDRMDRresistance to 3 classes of antimic

16、robial agentsresistance to all but 1 or 2resistance to allamong those drugsavailable at the time in most parts of the world potentially effectiveMatthew E. Falagas, et al. CID 2008:46(1): 1121-1122泛耐药菌株（PDR）的治疗多粘菌素替加环素第三节 其他临床常见非发酵菌病例患者，女，年龄17岁，由外院转入我院呼吸科，入院诊断：肺炎、感染性休克抗生素使用情况：入院前已使用较长时间泰能(亚胺培南)，效果不佳

17、。痰培养结果：嗜麦芽窄食单胞菌生长(+)。你的用药建议？窄食单胞菌Stenotrophomonas分类属于假单胞菌科（Pseudomonadaceae)临床分离有两个种: 嗜麦芽窄食单胞菌（S.maltophilia ） 非洲寡窄食胞菌（S. africana） 临床意义 条件致病菌 医院感染 临床最常见为嗜麦芽寡养单胞菌 主要引起菌血症、脑膜炎、尿路感 染、败血症、肺炎Stenotrophomonas maltophilia形态与培养特征形态：杆菌排列：散在排列染色性：革兰阴性特殊结构： 有鞭毛（极端丛鞭毛） 无芽胞 无荚膜嗜麦芽窄食单胞菌革兰染色嗜麦芽窄食单胞菌鞭毛培养特性： 专性需氧 营

18、养要求不高 最适生长温度3037 4 不生长 麦康凯平板可生长 Stenotrophomonas maltophilia形态与培养特征嗜麦芽窄食单胞菌菌落（普平）Stenotrophomonas maltophilia形态与培养特征嗜麦芽窄食单胞菌菌落（麦康凯）嗜麦芽窄食单胞菌菌落（血平板）生化特征： 氧化酶阴性 氧化分解葡萄糖 快速氧化分解麦芽糖 DNA酶阳性 明胶液化试验阳性 对碳青霉烯类抗生素天然耐药Stenotrophomonas maltophilia生化反应DNA酶阳性Stenotrophomonas maltophilia鉴定特征革兰阴性杆菌氧化酶阴性氧化分解葡萄糖和麦芽糖（后者

19、反应更强）DNA酶和赖氨酸脱羧酶（+）明胶水解（+）动力（+），鞭毛数2个对碳青霉烯类抗生素天然耐药抗生素应用根据2005年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)提供的标准：临床常规检测只做复方新诺明、左旋氧氟沙星、米诺环素。临床治疗首选复方新诺明；头孢哌酮/舒巴坦、替卡西林/克拉维酸保持一定的敏感性。嗜麦芽窄食单胞菌含有金属酶，对亚胺培南天然耐药，即使体外试验敏感，也不应该用于临床治疗。2008年嗜麦芽窄食单胞菌药物敏感率伯克霍尔德菌属Burkholderia分类：原属于假单胞菌属，目前已自成一个独立的属。与疾病有关的有四种： 洋葱伯克霍尔德菌（B.cepacia） 类鼻疽伯克霍尔德菌（B

20、. pseudomallei） 唐菖蒲伯克霍尔德菌（B.gladioli） 鼻疽伯克霍尔德菌（B. mallei） 临床意义广泛分布于自然界水、土和植物中。洋葱伯克霍尔德菌主要引起医院感染。类鼻疽伯克霍尔德菌引起的感染与结核相似。形态与培养特征形态：杆菌排列：散在排列染色性：革兰阴性特殊结构： 有极端鞭毛(鼻疽伯克霍尔德菌无鞭毛） 无芽胞 无荚膜洋葱伯克霍尔德菌鞭毛洋葱伯克霍尔德菌扫描电镜图形态与培养特征培养特征： 专性需氧 最适生长温度3037 营养要求不高形态与培养特征血平板48h类鼻疽伯克霍尔德菌菌落生化特征氧化酶阳性触酶阳性氧化利用葡萄糖硝酸盐还原（+）动力阳性(鼻疽伯克霍尔德菌阴性)

21、洋葱伯克霍尔德菌(普通平板)洋葱伯克霍尔德菌生化特征86%洋葱伯克霍尔德菌氧化酶阳性触酶阳性氧化利用大部分糖类不能还原硝酸盐为N2有多个极端鞭毛(2)耐药机制耐药机制不明确，对多种抗生素高度耐药。可产生A类碳青酶烯酶，对亚胺培南天然耐药，可对美罗培南敏感。米诺环素、复方新诺明可用于经验治疗。病例住院患者，入住ICU，气管插管。肺炎确定病原菌痰涂片：可见G-杆菌痰培养：1、灰绿色、溶血菌落(BP，巧克力平板)2、灰色不溶血菌落(BP，巧克力平板)1、G-杆菌，细长，氧化酶+2、G-杆菌，细长，氧化酶-上GN鉴定卡：1、铜绿假单胞菌2、洋葱伯克霍尔德菌药敏结果1、氨曲南：I，多粘菌素B：S，其它抗生素全部耐药。2、复方新诺明、米诺环素S，美罗培南、头孢他定R。产碱杆菌属和无色杆菌属Alcaligenes and chromobacter分类：属于产碱杆菌科临床常见的主要是: 粪产碱杆菌 木糖氧化无色杆菌木糖氧化亚种 临床意义存在于潮湿环境中条件致病菌