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文档简介

1、淋巴细胞的分离与计数从小鼠脾脏分离淋巴细胞利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载 玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（ 01mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来 换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格 网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在

2、计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中 方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即1625=400小方格。每一个大方格边长为1mm，则每 一大方格的面积为1mm2， 盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为01mm， 所以计数室的容积为01mm3。 实验器材Materials: 昆明小鼠 ( 2024 g), RPMI-1640培养基 75% 酒精，加样器，吸头，血球计数板，试管，滤网，手术器械实验步骤昆明小鼠断颈处死。消毒打开腹腔，分

3、离脾脏，置于培养皿中，加入少许培养基；将脾脏剪成小块，加入少许培养基；在100目滤网上研磨；将收集的细胞悬液于1500rpm离心5分钟；弃去上清，加入3ml蒸馏水或Tris溶液混匀，静置40s以破坏RBC；然后加入2ml培养基混匀；1500rpm离心5分钟，加入3-5ml培养基重悬细胞；悬液进行适当稀释，如不浓，可不必稀释。镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的菌液由盖玻片边缘滴一小滴（约10ul，不宜过多），让细胞悬液沿缝隙靠毛细渗透作用自 行进入计数室，一般计数室均能充满。注意不可有气泡产生。显微镜计数：静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现太浓或太稀，需重 新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510个细胞为宜。位于格线 上的细胞一般只数上方和右边线上的。清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留细胞或其他沉淀 物。若不干净，则必须

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