实验具体实施方案

1、课题设计（选题一：需1人完成）1、微生物的菌群随季节的变化规律（参照不同栽培年限人参根区土壤微生 物区系变化和草原土壤微生物受放牧的影响及其季节变化）1.1材料2011年3月，毛乌素沙漠采集供试土壤样品。采用5点取样法采 集人参根区510 cm处土壤样品，装入无菌聚乙烯自封袋中，采回土样即刻对 微生物进行分离、鉴定。1.2材料处理 采用稀释平板法1-3 对真菌、细菌和放线菌进行分离和数量 测定。真菌的分离用马丁氏或马铃薯培养基;细菌的分离用牛肉膏蛋白胨培 养基;放线菌的分离用高氏号培养基+重铭酸钾。准确称取10 g已过筛土壤, 加入盛有90ml无菌水的三角瓶中，加入玻璃珠后用振荡仪剧烈振荡30

2、S,得 10-1 土壤悬浊液。充分涡旋后，立即吸取1m l悬浊液加入另一盛有9m l无菌水 的试管中，得10-2 土壤悬浊液。按上述方法依次将土壤稀释成10-3, 10-4, 10-5和10-6的悬浊液。1.3 土壤微生物的分离、统计根据待分离的微生物类型，分别吸取不同稀释倍数的土壤悬浊液（真菌 为10-3,放线菌为10-4,细菌为10-5）0.2m,l加入至预先制备好的平板培养 基，用无菌涂布器将土壤悬浊液均匀涂布在培养基上，每种处理设3次重复。 将培养基在特定温度下恒温培养数天后观察、统计菌落数目。真菌培养温 度为25C ,培养时间为67 d;放线菌培养温度为28C ,培养时间为45 d;

3、细 菌培养温度为30C ,培养时间为24 d。根据不同培养基中生长出的菌落数 统计真菌、细菌和放线菌数量结合土壤样品的稀释倍数，按照公式:土壤微 生物浓度（cfu/g） = （菌落平均数X稀释倍数）/每皿菌液加入量（ml）,求得土 壤中可培养真菌、细菌和放线菌浓度。统计结果用SPSS 18. 0进行显著性 方差分析。1.4结果与讨论：菌落总数的变化规律，做图表。（选题二：需2人完成）微生物菌群随时间的变化规律微生物是土壤生态系统中的重要成员。它们可以分为细菌、放线菌、 真菌、藻类和原生动物等。由于土壤类型、植物群落和气候条件等因子的 影响，土壤微生物的分布类型和生理活性也存在着一定的差异。土壤

4、微生 物类群的特性和数量与土壤肥力和植物生长有密切关系。在土壤以及生物 圈的物质循环和能量流动中，土壤微生物起着关键作用。它们参于的主要 生态化学过程有：（1）有机化合物和动、植物及微生物残体的分解；固氮 作用;腐殖质的分解与形成；磷、硫、铁及其它化学元素的转化，以及碳、 氮、磷的生物地球化学循环等。在生态系统中，作为分解者的微生物，细 菌以占绝对优势的生物量起到重要作用，成为生物修复研究工作中的主要 对象。（2）微生物种群结构与多样性都是表征生态系统群落结构的重要参 数，其对环境污染物的反应表现为多种形式。有的表现为遗传适应，有的 表现为生理适应，有的则表现为种群结构的变迁，即以具抗性种取代

5、敏感 种。石油污染物进入土壤后对生态环境的影响首先表现为对土壤微生物的 影响，石油及其产品进入土壤能够导致土壤微生物种群数量的改变、群落 结构和组成的变化及群落多样性的变化。有调查表明，石油污染地区土壤 中的嗜油微生物数量（细菌、放线菌、真菌）与对照土相比有不同程度的增 长。这是由于石油污水长期灌溉，使得土壤中形成了土著嗜油微生物区系， 其中微生物类群以细菌为主，细菌的生物量总是占绝对优势 （李宝明，2004）。国内外许多学者应用传统的微生物培养技术和前沿的分子生物学技 术对石油烃污染土壤中微生物的生态过程进行了大量的研究。这些研究的 大多数结论表明石油污染能够导致土壤中微生物多样性的降低，不

6、同种群 在数量上的变化，群落结构和组成改变的同时石油烃降解菌群逐渐成为群 落中的优势菌群。在研究土壤石油烃污染对微生物影响的同时，也扩展了 对石油降解微生物的认识，发现了许多以前没有发现的降解菌种（李慧，2005）。（二）实验方案1营养液与含油废水的配制用电子天平称取NH4Cl 35g，KNO315.002g，K2HPO4 75.001g，NaH2PO4 28.302g,用量筒量取1000mL蒸馏水倒入1000mL的烧杯中，将称好的成分加 入烧杯中，用玻璃棒搅拌使其溶解，得到标准营养液，最后移入1000mL容 量瓶中备用。将马岭和华庆标准原油分别取0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10、

7、20、40、80g分别溶在200ml无菌水和200ml营养液中配制成0.1%、0.2%、0.5%、 1%、2%、5%、10%、20%、40%的含油废水，用于自然条件下和营养条件下土 壤添加碳源所用。2 土壤样品添加碳源选取陇东油区4种典型土壤（马岭未污染、马岭污染、华庆未污染、 华庆污染）土壤样品碾碎过40目筛，然后将土壤分别装入4个体积为21.6X 6X21.5cm3的玻璃缸。每缸装土2kg,每两缸为一组，分为两组：第一组：1#为马岭未污染土壤，自然条件，分别加0.1%、0.2%、0.5%、 1%、2%、5%、10%、20%、40%的马岭含油废水；2#为马岭污染土壤，分别加 营养条件下的0.

8、1%、0.2%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、40%的含油废水， 搅匀。第二组：3#为华池未污染土壤，自然条件；分别加0.1%、0.2%、0.5%、 1%、2%、5%、10%、20%、40%的马岭含油废水；4#为华庆污染土壤，分别加 营养条件下的0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、40%的含油废水， 搅匀。考虑到微生物有一定的存活时间，故拟定本实验历时42d，分别于0、7、 14、17、21、24、28、35、42d取样分析微生物的生长变化过程及污染物的 残留量。其中2#、4#每次取样后都添加营养液30mL。培养期间因土壤水分 挥发，应及时添加水分，保

9、持水分含量在18-20%。3微生物数量测定方法采用稀释平板法1-3 对真菌、细菌和放线菌进行分离和数量测定。真菌 的分离用马丁氏或马铃薯培养基；细菌的分离用牛肉膏蛋白胨培养基;放线 菌的分离用高氏号培养基+重铭酸钾。准确称取10 g已过筛土壤，加入盛有 90ml无菌水的三角瓶中，加入玻璃珠后用振荡仪剧烈振荡30S，得10-1土壤 悬浊液。充分涡旋后，立即吸取1ml悬浊液加入另一盛有9ml无菌水的试管 中，得10-2 土壤悬浊液。按上述方法依次将土壤稀释成10-3, 10-4, 10-5 和10-6的悬浊液。4.土壤微生物的分离、统计根据待分离的微生物类型，分别吸取不同稀释倍数的土壤悬浊液(真菌

10、 为10-3,放线菌为10-4,细菌为10-5)0.2m,l加入至预先制备好的平板培养 基,用无菌涂布器将土壤悬浊液均匀涂布在培养基上，每种处理设3次重复。 将培养基在特定温度下恒温培养数天后观察、统计菌落数目。真菌培养温 度为25C，培养时间为67 d;放线菌培养温度为28C，培养时间为45 d;细 菌培养温度为30C，培养时间为24 d。根据不同培养基中生长出的菌落数 统计真菌、细菌和放线菌数量，结合土壤样品的稀释倍数，按照公式:土壤微 生物浓度(cfu/g) = (菌落平均数X稀释倍数)/每皿菌液加入量(ml)，求得土 壤中可培养真菌、细菌和放线菌浓度。统计结果用SPSS 18. 0进行

11、显著性 方差分析。培养天数与四种土壤细菌数量的关系（X105个/g土）天数1#土样2#土样3#土样4#土样01.1052.20.0770.14175.0532.9527.5523.51425.9129.5267178.51767032025120.5219 3544837828.3249 686324031472890054030911235512.5214.54211.80.332.250.17（选题三：需4人完成）石油污染物的生物降解动力学研究3.1.污染物含量测定方法在加入含油废水后（0天）从4个缸中分别取土样10g，在7, 14, 17 天时从4个缸中分别取土样30g,在21天时从4个

12、缸中分别取土样20g （采 用五点法），分别放入4个索氏提取器中，用150mL沸程为60-90C的石油 醚索氏提取24小时，将提取液移入250mL的容量瓶中，用石油醚定容，用 紫外可见分光光度计测定4个缸中污染物的含量，得到缸中污染物的含量。 用索氏提取的方法提取土样中的污染物，用紫外分光光度计测得索氏提取 器中土中的石油类物质吸光D，根据马岭工作曲线（M=16.4474D-6.3559 ） 和华庆工作曲线（M=12.019D）得到石油类物质含量M，然后除以所取土样 克数得到不同大数污染物残留量，不同大数不同含有废水条件下污染物残 留量（石油类有机质），结果如表7-3-1表7-3-4所示，饱和

13、烃/芳烃和非 烃的残存量见附表。每次测三个重复，统计结果用SPSS18.0软件进行统计分析。3.2污染物的残留量的统计结果表7-3-11#土壤不同天数石油类有机质残留量（mg/g 土）天数含油污水浓度（）0.100.200.501.002.005.0010.0020.0040.0000.1360.3010.7881.6263.3128.05115.30231.09266.20570.0740.1770.4781.0052.0704.94510.09119.67140.462140.0500.1290.3580.7671.5933.7537.70714.90330.826170.0560.145

14、0.2780.6251.7103.0466.29113.07229.164210.0190.1490.2050.4600.9792.2184.6368.76218.544240.0170.1480.1940.4390.9382.1154.4308.34917.718280.0230.0780.2260.5021.0652.4325.0639.61620.252350.0140.0570.1810.4120.8841.9814.1627.81316.646420.0160.0630.1910.4330.9252.0834.3668.22217.464表7-3-22#土壤不同天数石油类有机质残留量

15、（mg/g 土）天含油污水浓度（）数0.100.200.501.002.005.0010.0020.0040.0000.2050.4301.1112.2424.52711.29622.61345.24690.51370.1110.2430.6391.2982.6386.57413.16926.35952.739140.0870.1960.5211.0632.1685.39810.81821.65643.333170.0950.2120.5611.0422.3265.79411.61023.24046.501210.0640.1480.4020.8251.6924.2098.43916.8993

16、3.819240.0480.0760.3220.7661.3743.4147.84911.71829.457280.0390.1000.2800.5821.2052.9926.00412.02924.079350.0400.1020.2860.5941.2293.0526.12612.27224.565420.0410.1040.2910.6021.2463.0946.20912.43924.0997-3-33#土壤不同天数石油类有机质残留量（mg/g 土）天含油污水浓度（）数0.100.200.501.002.005.0010.0020.0040.0000.1080.2140.5681.16

17、62.3535.46211.28421.50745.01470.0420.0940.2390.5091.0382.1744.7088.35618.712140.0410.1190.2020.5341.2891.8024.5638.16623.732170.0400.0910.2320.4951.0092.1034.5668.07118.142210.0260.0620.1600.3490.7181.3763.1125.16412.328240.0240.0580.1510.3310.6831.2872.9354.80911.618280.0270.0660.1670.3640.7471.448

18、3.2565.45112.902350.0220.0530.1380.3070.6341.1652.6904.31910.638表7-3-44#土壤不同天数石油类有机质残留量（mg/g 土）天含油污水浓度（）数0.100.200.501.002.005.0010.0020.0040.0000.2020.4321.0412.1124.24410.39920.97941.42783.85470.0940.1970.4981.0262.0734.97210.12319.71640.432140.0780.1650.4180.8671.7544.1758.52916.52834.056170.0790

19、.1690.4260.8831.7854.2548.68716.84434.688210.0770.1680.3240.8781.7763.2308.64116.75134.502240.0480.0740.1720.5750.7691.7134.6058.68018.360280.0310.0710.1830.3970.8131.8233.8267.12215.244350.0370.0850.2170.4640.9492.1614.5038.47517.950420.0380.0860.2180.4670.9542.1754.5298.52818.0563.3污染物的生物降解率及其动力学特

20、征用每一次测得的残留量数据与0天时的数据相除，得出不同天数残留 量与第一天相比的相对值（相对残留量%），然后绘出不同天数测得的污染物 相对残留量与不同天数细菌总数变化图（表7-3-7）。以浓度为2%的含油废 水在微生物作用下污染物相对残留量值为例（表7-3-8），计算降解率与降 解系数。结果表明相对残留量总的趋势是减小，但降解过程中还是有一些 波动。1#和2#中的土样在第13天时降解已经达到52%。21天时，1#的相对 残留量达到一个最低值，这与细菌的数量在21-28天时最大是基本符合的； 24天时，2#的相对残留量达到一个最低值，这与细菌的数量在24-28天时 最大是基本符合的。3#和4#中

21、的土样在第7天时降解已经达到51%-55%。 21天时，3#的相对残留量达到一个最低值，这与细菌的数量在21-24天时 最大是基本符合的；24天时，4#的相对残留量达到一个最低值，这与细菌 的数量在24-28天时最大是基本符合的。总的来说，在0-13天时3#和4#中降解率比1#和2#中的快一些，这可能是在未经培养过的华庆土壤中的细 菌比马岭土壤中的细菌多。另外，在第17天时，1#和2#土样都出现一个峰 值；在13天时，3#土样出现一个峰值；在21天时4#土样出现一个峰值； 原因可能是细菌在降解污染物时，产生的代谢物与污染物结构相似。同时，可以明显看出1#和2#土样的生物降解过程在前13天符合一

22、级 动力学方程；3#和4#土样的生物降解过程在前7天符合一级动力学方程。 所以1#和2#土样且对13天前的降解作动力学研究；3#和4#土样且对7天 前的降解作动力学研究。表7-3-72%含油废水在微生物作用下污染物相对残留量值（）天数1#2#3#4#0100.00100.00100.00100.00762.5058.2844.1048.841448.1047.8954.7741.331751.6351.3942.8942.072129.5637.3830.5441.852428.3221.5126.9418.122832.1426.6231.7619.163526.7027.1626.9422

23、.354227.9327.5325.9322.48星里留残对相0.00% 0714172124283542天/d100.00%80.00%60.00%40.00%20.00%图7-3-2 2%含油废水在微生物作用下污染物降解曲线12001000图7-3-3细菌总数变化图1#2#3#4#土 0 5 0细根据一级动力学方程K=0.693/t0.，得到马岭和华庆地区生物降 解半衰期和降解系数（表7-3-8）。华庆原油的生物降解系数比马岭 原油的生物降解系数大，这是因为华庆油田的土壤中降解菌数量比马 岭油田的土壤中降解菌数量多。表7-3-8 生物降解特征华庆马岭编号1#2#3#4#t0.5 (d)12

24、.5212.476.26生物降解系数(mg/d)0.05540.05560.11070.1013(选题四：需要4人)4.微生物的富集与分离土壤样品：取自油田土壤，取土表及以下5 cm 15 cm的耕层土 壤。培养基的选择方法一，需2人(参考氯嘧磺隆降解菌的分离鉴定及 其降解特性)LB培养基(g):酵母粉5,蛋白胨10, NaCl 5,蒸馏水定容 至 1 L。无机盐培养基(g): K2HPO4 0.5, KH2PO4 0.5,葡萄糖 5, NaCl 0.2, MgSO4 - 7H2O 0.2, CaCl2 0.1,蒸馏水定容至1 L, 添加不同 体积原油母液(1000 mg/L)。2.2原油降解

25、菌株富集与分离取10 g 土样放入装有90 mL无菌生理盐水的三角瓶中，加适 量玻璃珠摇床振荡约30 s,使样品与水充分混合，将细胞分散, 形成均匀的菌悬液。以10%的接种量接到含100 mg/L原油的无机盐 培养基中，置30C、150 r/min的摇床振荡培养。以后每周移种 一次，以接种量10%接入新鲜的无机盐培养基中，原油浓度以100 mg/L的梯度递增，至培养基中原油浓度达到500 mg/L。经初筛、 复筛和纯化后，将分离的几株降解菌接种于LB斜面上，编号，4 C 冰箱中保存。2.3原油降解菌株的鉴定。培养基的选择方法二，需2人（参照石油烃降解菌的筛选与鉴定）富集筛选培养基（g/L）:

26、NaNO3 2，K2HPO4 0.5，KH2PO4 1，无水 MgS040.05,无水 CaCl2 0.01, NaCl 0.5, FeSO4 . 7H2O 0.01, PH7.2, 石油5。选择鉴定培养基（g/L）： NaNO3 2, K2HPO4 0.5, KH2PO4 1,无水 MgSO40.05,无水 CaCl2 0.01, NaCl 0.5, FeSO4 . 7H2O 0.01,琼脂 18, pH7.2，石油 53.3菌种纯化培养基：牛肉膏蛋白胨（g/L）：牛肉膏3,蛋白胨10, NaCl 5,琼脂 18, pH7.4-7.6o3.4斜面保存培养基：牛肉膏蛋白胨3.5石油降解菌的富集

27、分离无机盐培养基中加0.5% （W/V）原油样品，30C摇床培养7d，取5ml 液接到相同新鲜无机盐培养基中，同样条件下培养7d。如此连续富 集培养取0.5ml在固体无机盐培养基平板上涂布，用微型喷雾器喷撒 原油，使原油为05%,在30C温箱中培养20天，选择在原油平板上 生长的菌株在牛肉膏胨培养基上纯化。纯化好的菌株再在固体无机盐 培养基平板上划线，然后再型喷雾器喷撒原油，使原油浓度仍为 0.5%。放置在30C温箱中培养，选择油平板上生长较快的菌株，用 牛肉膏蛋白胨进行划线纯化，纯化后的菌株以膏蛋白胨斜面保存 63。在液体LB中接入原油降解菌，生长好后加入甘油，油终浓度 为25%,置-20笆

28、冰箱保存。2.6高效降解菌株的筛选3.6.1培养方法 3.6.1.1种子培养 于新鲜斜面上取两环菌，接至装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中C, 180rpm振荡培养24ho3.6.1.2摇瓶培养 按5%接种量，将培养24h种子液接入50ml发酵培养基的500ml三 角瓶30C, 180 rpm培养10d。为减少测定误差，每个样品均做三个 平行样，同不接种微生物的摇瓶作为对照以扣除非生物影响。3.6.2石油降解菌除油率的测定在液体原油培养基中接种石油降解菌，经摇床培养后，加入20ml石 油（30-60）C萃取，并将培养液5000r/min离心10min，转至分液 漏斗，振荡次，静置，待分

29、层后分离，收集上层液，用石油醚洗涤 2-3次，合并上层液在烤箱中65C蒸干，冷却后称重。除油率的计算除油率=（m3 一m2）/m1 X100%m3对照组的残余油量，m2降解后的残余油量，m1最初的含油量。（选题五、需要6人）：降油因素研究（参考氯嘧磺隆降解菌的分离鉴定及其降解特性）1.确定初始条件一致：在LB液体培养基中培养18 24 h （OD600=后 ，按5%的量接种无机盐培养基中，初始pH值为？r/min恒温摇初始原油浓度为？ mg/L,温度为？ C, 床振荡培养，分别进行以下几组处理测定生长量和降解率的变化， 每种处理设3个平行试验，同时设接种灭活的菌株为对照，培养7 d后测定OD6

30、00值和氯嘧磺隆的残留量。每隔24 h取样测定菌株生长量和降解率的变化。将温度分别设置为20 C、25 C、30 C、35 C、40 C、45 C作为最佳温度试验组。用NaOH或HCl调节初始pH值分别至1、4、5、6、7、8、9作为 最佳pH试验组。将接种量分别设置为2%、5%、10%、15%、18%、20%作为最佳接种 量试验组。将原油浓度分别设置为10、50、100、200、300、400 mg/L作为 最佳降解浓度试验组。将菌株的培养时间、队接种量、温度、原油浓度都设置为优化 后的最佳条件，测定原油的降解率。(选题六，需要2人)6翻耕和加入膨松剂改良土壤强化降解效果实验1 5.1生物菌

31、剂制备以含油土壤为菌源，以原油为唯一碳源进行上述筛选分离，得到高 效石油降解菌，将斜面培养的菌株进行活化,在无菌条件下，高速离心 后,弃去上清液，离心管内的菌体在无菌室内37C干燥48h制成固体生 物菌剂备用。取一定量固体生物菌剂加入到无菌缓冲溶液中，使固体菌剂全部 分散制成菌悬液;把富集培养基按一定比例加入到膨松剂锯末后湿热 灭菌；然后把菌悬液加入灭菌后的培养基和锯末中并在培养箱中培养 24h制成扩大菌剂；最后将配制好的菌剂接种到被石油污染的土壤中。1 5.2试验设计为寻找生物修复石油污染土壤的强化处理方法，进行添加膨松剂 和翻耕处理的生物修复模拟试验。试验在盆钵（直径为15cm，高15cm

32、） 中进行，每组试验用土 1000g，人为添加污染源2g，各组试验的具体处 理措施如下表：项目菌剂量（mg/kg）锯末剂量（g）处理翻耕和剂量00静置0.60静置0.680静置00每天翻耕一次0.60每天翻耕一次0.680每天翻耕一次翻耕频率0.680每天翻耕一次0.680每三天翻耕一次0.680每五天翻耕一次0.680静置每一组做两个平行样。试验在实验室常温条件下进行。间隔一段 时间采样，并测定土壤中石油含量、微生物数量、电导率、含水率及pH值，随着土壤中石油去除率的降低，采样间隔逐渐增大。石油类含量采用紫外分光光度法测定；电导率（EC）采用电导率 仪测定；PH值采用精密PH计测定，电导率和

33、?日测定按土壤和水体 积比为1：5 （W/ V）；含水率采用恒重法测定。（选题七，需要2人）：添加营养剂强化修复土壤实验1.6.1实验材料主要培养基：LB培养基；牛肉膏蛋白胨培养基；MRS培养基；YEPD 培养基。有机肥：腐植酸、诺沃肥（由天津市诺维信生物技术有限公司提供， 为酶制剂经分离后形成的发酵残渣，其主要成分是发酵过程中未消耗尽的农产品、营养盐以及酶分离所使用的硅藻土等助滤物质。）、生 物有机钙（主要成分为贝壳粉）。1.6.2混合菌剂的培养采用三级扩大培养法。在30C、200r min-i条件下，将优势降油 菌种分别培养，经平板稀释法检查菌落数大于1X10i0cfumL-i后， 以腐植

34、酸-诺沃肥（1 ： 1）粉末为载体将菌液等体积同时吸附于载体 上（载体与菌液的质量比为2.5 ： 1）制备成菌剂，密封于聚乙烯塑料 袋内，室温保存。1.6.3 土壤中细菌数量和石油烃含量测定用平板计数法测定土壤中细菌的数量。土壤中总石油炷含量的测 定采用重量法。用索式提取法提取土壤中的总石油炷，计算每克干土 中总石油烃含量，进而按下式计算石油烃降解率:石油烃降解率=叫叫）M1X100%式中：M1为第1天土壤中总石油烃含量，mgkg-i；M|为第i天土壤 中总石油烃含量，mg kg-i。1.6.4 土壤盐碱化的改良及模拟原位修复处理方法首先，对土壤进行盐碱改良，取200g浇1次透水（即花盆底部有

35、 水渗出）后自然风干的土样，再加入5%腐植酸-诺沃肥（1 : 1）粉末 （W/W）、5%生物有机钙和2%磷酸二氢铵并充分混合均匀。然后，将 改良后的土壤装入花盆，分别按照0 （记为CK）、2%、4%、8%的比例 加入混合菌剂，混合均匀后于室温下培养，每周浇水两次，保持含水 率20%左右。每个处理设置3个平行。分别于第1、4、8、16、32、48 和64d测定石油烃降解率、土壤中细菌总数、电导率、含水率及?日 值。（选题八，需要4人）：石油降解菌剂对土壤耐碱、耐盐、温度、湿度等调 控因子的适应实验17.1 土壤温度的调控温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一，微生物的活动强度、生化作用都与此相

36、 关。温度的过高或过低都可抑制微生物生长或导致微生物死亡环境中的微生物均在一定的 温度范围内生存，温度的适中可使细菌细胞中的生物化学反应速率加快。试验阶段监测地表 的最高和最低温度数据。在试验区用农用塑料薄膜进行保温，使试验区土壤温度保持在25r以上，但进入9月后 因气温明显下降夜晚再用草帘覆盖。通过试验可得出在该地区利用微生物生态修复技术的最 佳时期，以及通过调控可使土壤温度保持在20C以上的办法。土壤含水量、易溶盐（TDS）、NH4+、NO3含量分析水是细胞生存不可少的物质，也是微生物对石油污染物降解过程中的重要介质和氧的 来源。因此在试验区要使土壤保证需要的水量，一般保持在20%左右，在

37、每次取样后加入约4% 左右的水，使试验层土壤含水量保持稳定这一含量基本能保证试验效果。并在实验区测定 当地土壤中水的TDS、NH4+、NO3含量。土壤中氧的调控环境条件的调控包括氧气的供给，氧的供应成为微生物降解有机物过程的重要调控因 子之一。供氧量的多少能影响微生物细胞内许多酶的活性和细胞的呼吸作用，控制着微生物 的生长和对有机物的降解能力。尤其是对石油污染的微生物降解尤显重要一般每氧化3.5g 石油需要1g 02。只有在氧充分的条件下才能迅速降解。本试验主要从3个方面对土壤氧的 供给进行了调控，首先是充分翻耕土壤并且在每次取样后均要翻耕试验层，使其充分与大气 混合。其次是保证试验土壤具有一

38、定的含水量，水中提供的氧。另外是利用锯末作为添加剂, 该添加剂不仅廉价易取，并能为土壤补充营养素，而且对试验层土壤条件进行了改良增大了 蓬松性和通透性，使空气中的氧容易进入。加入的营养元素N03-不仅增加氮源也是氧的来源 之一。上述调控措施为微生物降解土壤中的石油提供了充分的氧源。1.7.4 pH对降解率的影响环境的pH对微生物的生命活动有一定影响，它可引起细胞膜电荷的变化，而影响微生 物对营养物质的吸收以及酶的活性，并使环境中营养物质的可利用性和有害物质的毒性改 变。每一种微生物的生存都有一定的pH值范围和最适pH值。大多数细菌的最适pH值为 6.5-7.5,放线菌pH值为7.5-8.0,真

39、菌可以在广泛pH范围内生长发育，如pH值在3以下 9以上仍能生长，最适在5-6。试验区可加入一定量的磷酸盐缓冲剂使pH值保持在7-9,大 多在8左右，而大部分石油降解菌最适环境为偏碱性。用浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲剂将无机盐培养基的pH值调整到4.0、5.0、6.0、7.0、 8.0和9.0，灭菌后分别接种降解菌，于28C、120r/min摇床上恒温培养，7d后测定降解体 系中的原油降解率,以确定菌株降解原油的最适pH值。1.7.5盐度对降解率的影响培养基的盐度分别为0、2、4、6、8g/L,加入无机盐培养基灭菌后分别接种降解菌，于 28C、120r/min摇床上恒温培养,7d后测降解率，以确定菌株降解原油的最适盐值。1.7.6试验过程对下层土壤的影响试验完成后对试验各区下部土壤不同深度进行了石油、pH、含水量、易溶盐(TDS)、NH4+、 no3-含量测试。从测试结果可见试验区试验层的下部土层石油含量的变化。与对照区对比 说明试验层土壤中石油是否向下扩散或是被降解，从pH、含水量、易溶盐、NH4