昆虫解毒代谢

1、关于昆虫解毒代谢第一张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第一节 前言一、研究昆虫解毒代谢的意义二、昆虫对毒物的代谢 I. 解毒作用：有毒物质进入昆虫体内，昆虫体内有多种防御机能，能将有毒物质迅速代谢为无毒物质，使机体保持正常状态而不受其害，这种代谢称为解毒作用。 II. 活化作用：有些化合物在生物体内，经代谢转化成比原化合物更毒的物质，这种代谢称为活化作用。第二张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月I. 昆虫解毒代谢的类型： (1) 初级代谢（型反应）：主要包括对外来化合物的氧化、水解、还原以及基团的转移。 (2)次级代谢（型反应）：初级代谢的产物（主要具有-OH、-SH、-NH

2、2、-COOH的基团）与内源物质（轭合剂）结合，最后排除体外。 农药在昆虫体内的轭合形式主要是氨基酸反应，包括与单氨基酸类的轭合和复氨基酸的轭合、及与硫酸酯的轭合、与谷胱甘肽的轭合、烷基化和酰化反应等。轭合后的轭合物比农药本身的亲水性更强，更容易从动物体内排出。第三张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月药物杀虫剂其它外来化合物初级产物次级产物初级代谢氧化、还原、水解、基团转移次级代谢葡萄糖、氨基酸、硫酸、磷酸等共轭脂溶性水溶性第四张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第二节 氧化代谢（MFO) 氧化代谢中所涉及到的酶系很多，主要有：脱氯化氢酶（deyudrochlorinase）、

3、微粒体多功能氧化酶（microsomal mixed-function oxidases，MFO）、谷胱甘肽转移酶（glutathione-transferases，GST）及各种酯酶（esterases）等。其中微粒体多功能氧化酶具有底物广谱性的特点，能参与对各种杀虫剂（包括有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、化学不育等等）及有毒物质的解毒作用，在有毒物质代谢中起着非常重要的作用。第五张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月一、微粒体多功能氧化酶作用方式及机理(一)微粒体多功能氧化酶研究历史 1. 1943年Claude把通过差速离心分离出来的亚细胞颗粒（直径约200m）称之为微粒体

4、。 2. 1954年Axelrod首先发现兔肝微粒体对苯异丙胺具有脱氨氧化作用，此后人们才开始注意到微粒体在氧化代谢中的重要作用。 3. 1958年，Brodie等证明了离体的微粒体氧化酶要起作用，需要氧和还原性辅酶（NADPH） 4. 昆虫中的微粒体氧化酶是Agosin等于1961年首次在德国蜚蠊中发现的。第六张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月（二）微粒体多功能氧化酶的组成及性质 MFO是一个酶的复合体，主要包括：细胞色素P450、黄素蛋白-NADPH-P450还原酶、细胞色素b5、黄素蛋白-NADH-细胞色素b5还原酶和磷脂等成分组成。第七张，PPT共一百零三页，创作于2022年

5、6月1.细胞色素P450的特性(1)光学特性 微粒体被还原后可以与CO结合形成复合体，通过双光束扫描分光光度计扫描，在波长450nm处出现一个最大吸收峰。除了与CO结合外，细胞色素P450可以与许多物质结合，结合后所诱导产生的光谱，按其性质可分为三类：型：波峰在390-410，波谷在425-435nm； 型：波峰在425-435nm，波谷在390-410nm； M型：最大和最小吸收峰分别在325和420nm 。第八张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月棉铃虫中肠细胞色素P450 CO 差光谱图第九张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月棉铃虫中肠Cyt P420-CO差光谱第十张，P

6、PT共一百零三页，创作于2022年6月(2)不稳定性第十一张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月10,000g离心20min沉淀（细胞核、碎片、线粒体）100,000g 离心60min微粒体微粒体上清液线粒体上清液粗匀浆液中肠或脂肪体差速离心第十二张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月 P450s的氨基酸同源性大于40时为同一家族；若大于55%时为同一亚家族若大于55%时为同一亚家族，大于80属于等位基因，大于97属于等位基因的变异体。等位基因用v1、v2等表示，假基因用p1、p2等表示。 例外 ： CYP6A1和CYP6B2虽属于同一6家族，但是这两个蛋白的氨基酸的同源性却低于4

7、0 (3) 命名第十三张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月 (4)多样性P450基因已经有35亿年的历史。现在所有的p450s均来自一个共同的古老的基因。现在认为当前p450 超家族是通过基因扩增或基因适应多样化形成的。 P450基因属于基因超家族(superfamily)，目前已知，该超家族包括70个家族(family)，120个亚家族(sub-family)（Nelson,1998），并且不断有新的成员加入，其数量增长很快。第十四张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月 到目前为止，p450超家族已发现1200种基因，哺乳动物中有大约310种。到2000年春季，植物中已知的p4

8、50基因有513种。细菌和低等的真核生物中的p450有接近100种已命名。人类有56种。(I) p450家族数目第十五张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月(II) P450s的进化分子驱动学说指出，一个种群基因型组分的改变是由于DNA翻转内在的动力而非自然选择造成的。假基因是一段与功能基因相似的序列，但不能形成蛋白产物。假基因的识别要么通过编码区的异常或转录的异常，或两者兼有。 第十六张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月(III) 同工酶的多样性 果蝇基因组的序列揭示了在果蝇中有86个公认的p450基因，4个假基因，归属25个不同的家族。来自家族4与6的基因数目大约占这个中群p

9、450s的一半多。在86个基因中，CYP6A17和CYP6A23具有最高的相似性，达到84.2。仅有10对的相似性大于70。 第十七张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月 其表达与昆虫的发育阶段、性别、组织、品系及取食有关。 (IV) 表达的多样性第十八张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月细胞色素P450基因调控的多样性调节步骤举例基因转录1A1 1A2 2B1 2B2 2C7 2C11 2C12 2D9 2E1 2H1 2H2 3A1/2 3A6 4A1 11A1 11B1/17 2C12 2E1加工1A2mRNA的稳定性1A1 2B1 2B2 2C12 2E1 2H1 2H2

10、 3A1/2 11A1翻译2E1酶的稳定性2E1 3A1/2 3A6第十九张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月(5) 可诱导性 现已证明，许多化合物，如药物、杀虫剂、以及植物他感化和物都能诱导P450的生物合成。目前搞的比较清楚的是苯巴比妥和3-甲基胆蒽可诱导P450的合成。第二十张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月槲皮素（0.01%和0.02%）对棉铃虫幼虫P450s诱导的时间效应第二十一张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月单宁（0.1%和0.5%）对棉铃虫幼虫P450s诱导的时间效应第二十二张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月 十三烷酮(0.02%)对棉铃虫

11、中肠细胞色素P450的诱导作用时间4162640507296CK中肠1.502.292.243.072.584.322.581.22倍数1.221.871.842.512.113.532.11第二十三张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月(6) 分离昆虫p450s的方法1 全基因测序2 蛋白纯化 3 用已知的p450s作为探针 4 利用兼并引物 5 差异或消减筛选 第二十四张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月 P450纯化可通过两个途径: (1)直接从生物体组织中分离，(2)通过分子生物学方法获得P450基因，再进行异源表达纯化P450蛋白。 从生物组织中直接分离P450蛋白一个

12、首要解决的问题就是需要大量的组织材料.另外生物体内蛋白种类多，要经过繁琐的步骤进行分离.这样容易造成P450蛋白失活，而通过P450差光谱就很难鉴定。通过P450其它种类已分离450蛋白的抗血清或特异性抗体加以解决。第二十五张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月槲皮素F1对照中肠、脂肪体Buffer A微粒体溶解微粒体差数离心10%chaps40%PEGBuffer B微粒体增溶杂蛋白沉淀DE-32Buffer C0-60%NaClSDSP450蛋白纯化的研究实验流程第二十六张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月中肠或脂肪体RNAcDNAPCR扩增目的片段回收转化DH5菌株与pGE

13、M-T 载体相连酶切鉴定蓝白斑筛选SP6/T7测序序列分析第二十七张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月分离昆虫p450s的方法 家蝇CYP6A1和果蝇CYP6A2的cDNA文库就是通过p450的抗体筛选得到的cDNA文库。 CYP6B3就是通过用CYP6B1CDNA为探针分离得到的。 第二十八张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月(7) 昆虫p450s的底物 昆虫单加氧酶可代谢内源性物质诸如保幼激素、蜕皮激素及其类似物等，也可代谢外源物质如次生物质、杀虫剂及前诱变剂。 第二十九张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月2. 细胞色素P450酶系氧化底物循环作用机理(1) 底物与

14、酶结合，酶上的铁原子由于NADPH-细胞色素P450还原酶供给一个电子使得三价铁还原为二价铁。(2) 铁的还原作用使其与分子氧结合。(3) 另一个电子和质子加到铁上形成FeOOH复合体。(4) 失去一分子水后形成（FeO）3+复合体，此复合体将其氧原子转移到底物上。(5) 被氧化的底物释放出来，游离的细胞色素P450又重复下一个循环。第三十张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月Monooxygenation reactions catalysed by cytochrome P450第三十一张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月Monooxygenation reactions c

15、atalysed by cytochrome P450第三十二张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月Monooxygenation reactions catalysed by cytochrome P450第三十三张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月催化反应机制 RH + O2 + NADPH + H+ ROH + H 2O + NADP+ 这一循环开始于酶作用物与亚铁血红素的结合，通常诱导铁旋转状态由低自旋到高自旋底改变。铁通过从氧化还原配耦体转移出一个电子被还原成亚铁形式并和氧迅速结合。第2个电子转移到亚铁血红素导致氧分子分裂成瞬时底介体并释放水。最终，活泼底介体攻击酶反应

16、物导致化合物单加氧化。 第三十四张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月P450对底物的氧化循环机理Fe3+P450底物OHFeOOHP450底物HFe2+ O2 P450底物HFe2+P450底物HFe3+P450底物HFe3+P450底物OH底物H(FeO)3+P450底物HH+H2OH+1NADPHe-NADPHe-O2第三十五张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第三十六张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第三十七张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第三十八张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第三十九张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第四十张

17、，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第四十一张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第四十二张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月3 从p450s研究中获得信息(1) 杀虫剂抗性 (2) 植物昆虫相互作用 (3) 昆虫生理知识 第四十三张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月植物昆虫相互作用 黑尾凤蝶能够取食含有呋喃香豆素的大多数植物，并能忍受含有0.1花椒毒素。在这个种中，花椒毒素可被p450单加氧酶代谢，诱导的p450 的活性接近5倍。第四十四张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月二、多功能氧化酶作用方式O、S和N-烷基的羟基化作用脂族羟基化作用和环氧化作用芳香族

18、羟基化作用有机磷酸酯的脂族氧化作用氮和硫醚的氧化作用第四十五张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月Monooxygenation reactions catalysed by cytochrome P450第四十六张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月1. O、S和N-烷基的羟基化作用（西维因的N-烷基羟基化作用）西维因1-萘基-N羟基-氨基甲酸甲酯第四十七张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月O、S和N-烷基的羟基化作用（西维因的N-烷基羟基化作用）第四十八张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月Monooxygenation reactions catalysed b

19、y cytochrome P450第四十九张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第五十张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月2. 脂族羟基化作用和环氧化作用 DDT三氯杀螨醇OHHMFO(1) DDT的羟基化作用第五十一张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月艾氏剂狄氏剂.芳基羟基化作用和环氧化作用2.艾氏剂的环氧化作用MFOO第五十二张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月NADPH,O2微粒体萘 1，2-二羟基-1，2-二氢化萘-萘酚芳香族羟基化作用萘的羟基化作用第五十三张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月NADPHO2NADPHO2对硫磷二乙基硫代磷酸4-硝基

20、酚有机磷酸酯的脂族氧化作用（对硫磷）第五十四张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月NADPHO2NADPHO2甲基对硫磷二甲基硫代磷酸4-硝基酚有机磷的脂族氧化作用（甲基对硫磷）第五十五张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月Metabolic disorders caused by mutations and polymorphisms in P450 oxidoreductase第五十六张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月Most drugs and xenobiotics are metabolized by a small number of hepatic cyto

21、chrome P450 enzymes. All drug metabolizing P450 enzymes receive electrons from NADPH through a single flavoprotein known as NADPH-P450 reductase. We have recently identified mutations in NADPH P450 reductase from patients with disordered steroidogenesis. Polymorphisms in the drug metabolizing enzyme

22、s, especially cytochrome P450s are well known to be responsible for variations in drug responses. My preliminary work on mutant and polymorphic P450 reductase suggests that many drug metabolizing P450 enzymes are severely affected by an abnormal P450 reductase enzyme. 第五十七张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月Since

23、 all liver P450 enzymes need P450 reductase for activity, it is seems likely that changes in P450 reductase may produce drug responses that are phenotypically similar to one or more cytochrome P450 mutations / polymorphisms. As an example, in the first report of P450 reductase mutations, the disease

24、 profile of hormonally impaired patients suggested a defect in P450c17 or P450c21 but no mutation in any of these enzymes was found and it was the defective P450 reductase that produced a phenotypic response similar to defective P450c17 and P450c21. Sequencing data from normal population has reveale

25、d several variants of NADPH P450 reductase enzyme. These P450 reductase variants are being tested for the electron transfer activities towards various cytochrome P450 enzymes. First set of P450 reductase mutations had been tested for activity towards P450c17 and aromatase (CYP19A1).第五十八张，PPT共一百零三页，创

26、作于2022年6月第三节：有毒的其它初级代谢一：杀虫剂的水解代谢A酯酶主要是芳基酯酶，能水解某些含芳基的磷酸酯类杀虫剂，B酯酶包括了胆碱酯酶，羧酸酯酶核酯酶。第五十九张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月Aldridge（1953）根据酯酶与有机磷的相互作用把酯酶分为三类 ：(1）A-酯酶，这类酶能耐受有机磷，并把它们作为底物进行水解；(2）B-酯酶，这类酶对对氧磷等有机磷很敏感，能被这些有机磷抑制；(3）C-酯酶，既不被有机磷抑制，又不能水解这些有机磷。 第六十张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月杀虫剂的水解代谢主要包括： （一）磷酸三酯的水解 （二）羧酸的水解 （三）酰胺的水

27、解第六十一张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月（一）磷酸三酯的水解 磷酸三酯能够被磷酸三酯水解酶水解。此酶主要作用于磷酯和酐键。在以前用了很多名字描述这种酶，例如：对氧磷酶、A酯酶、磷酸酯酶、磷酰基磷酸酶、芳基酯酶等，实际上都属于磷酸三酯水解酶。 一般，水解磷酸酯酶系大多是根据其水解底物的名称来命名的。目前发现的水解酶主要包括：DFP酶、芳族酯水解酶、O-烷基水解酶、磷酸二脂水解酶。 1.氟水解酶(Fluorohydrolases,DFP酶) 2.芳族酯水解酶 3.O-烷基水解酶 4.磷酸二脂水解酶第六十二张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月（一）磷酸三酯的水解+H2O+ HX

28、+H2O+ ROH第六十三张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月1. 磷酸三酯的水解+ H2O+ HF氟水解酶（DFP酶）第六十四张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月H2O+2. 芳族酯水解酶OHHO第六十五张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月H2O+ CH2OH3. O-烷基水解酶DDVP第六十六张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月+H2O+4. 磷酸二酯的水解HOHOCH=CCL2第六十七张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月（二）羧酸的水解 羧酸酯酶(Carboxylesterase)，属于B酯酶，又称脂族酯酶，能催化各种脂族酯和芳族酯的水解，但不能水

29、解胆碱酯。 目前研究表明羧酸酯酶在一些有机磷和拟除虫菊酯的代谢中起着重要的作用，这种酶的活性一般在正常的昆虫品系中是比较低的而在某些抗性品系中比较高。 羧酸酯酶通过附加一分子水而将底物裂解成酸和醇两部分。例如：将马拉硫磷水解，形成，单酸以及醇。第六十八张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第六十九张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第七十张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月（二）羧酸的水解H2O+ 2C2H5OH马拉硫磷马拉硫磷-单酸马拉硫磷-单酸+第七十一张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第七十二张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第七十三张，PPT共

30、一百零三页，创作于2022年6月（三）酰胺的水解H2O+ CH3NH2乐果乐果酸 酰胺酶可以水解含酰胺键的化合物。例如将乐果水解成乐果酸。第七十四张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月（四）环氧化物水解 环氧化物的水解由环氧化物水解酶催化，昆虫中存在家蝇、红头丽蝇、黄粉甲、亚热带粘虫H2O第七十五张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月二 还原代谢 还原代谢没有氧化代谢那么普遍。在动物体内这种代谢多发生于那些含硝基苯核或含卤原子的化合物，在酶或细菌的作用下，被转化为相应的氨基化合物及脱卤代谢物。如：DDT转变为滴滴伊的反应，就是通过脱氯化氢酶的作用，一个卤原子被氢所取代。含硝基苯母核

31、的农药，如：苯硫磷、对硫磷、杀螟松等化合物在动物体内容易被还原为氨基衍生物。在昆虫中发现了硝基还原和偶氮还原两类。如对硫磷在依赖于NADPH的硝基还原酶的作用下被还原成胺基对硫磷。第七十六张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月二、还原反应对硫磷氨基对硫磷NADPH 硝基还原酶NH2NO2第七十七张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月三 以谷胱甘肽为介质的代谢 许多外来化合物的代谢都与谷胱甘肽（GSH）有关，杀虫剂以及其代谢产物也能够被以谷胱甘肽为介质的系统代谢。这种代谢有两类，第一是GSH以纯粹催化剂的形式被利用；第二谷胱甘肽直接与底物结合而被消耗，至少在反应初期是这样的，并不能再

32、生，而是排除体外。第七十八张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第七十九张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第八十张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第八十一张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月X-ray structure of glutathione S-transferase from the malarial parasite Plasmodium falciparum第八十二张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月X-ray structure of glutathione S-transferase第八十三张，PPT共一百零三页，创作于2022年6

33、月X-ray structure of glutathione S-transferase单体双体第八十四张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月（一）谷胱甘肽催化代谢DDT脱HClCCl-ClC+ GSH + HCl + GSH第八十五张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月 (二) GSH消耗代谢 GSH-S-转移酶 此酶属于共轭反应类型，在以后还会介绍。GSH和底物结合，一般有两种类型。第一：GSH代替底物中不稳定的部分：第二：直接进攻底物分子二乙基顺丁烯二酸第八十六张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月1. GSH-S-烷基转移酶 GSH+ CH3-SG甲基对氧磷第八十七

34、张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月2. GSH-S-芳基转移酶二嗪农+第八十八张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月3. GSH-S-芳烷基转移酶+ GSH+ HCl苄基氯第八十九张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月4. GSH-S-链烯转移酶+ GSH二乙基马来酸酯 以下两类反应是通过GSH-S-转移酶直接将GSH转移到底物分子中第九十张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月5. GSH-S-环氧基转移酶+ GSH1,2 环氧乙基苯第九十一张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月第四节 杀虫剂的次级代谢 (共轭代谢) 次级代谢（型反应）：初级代谢的产物（主要具

35、有-OH、-SH、-NH2、-COOH的基团）与内源物质（轭合剂）结合，最后排除体外。农药在昆虫体内的轭合形式主要是氨基酸反应，包括与单氨基酸类的轭合和复氨基酸的轭合、与硫酸酯的轭合、与谷胱甘肽的轭合、烷基化和酰化反应等。轭合后的轭合后的轭合物比农药本身的亲水性更强，更容易从动物体内排出。第九十二张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月一、共轭反应 共轭反应主要指天然的或外来的化合物及其代谢物与内源性的中间产物结合。具有中间代谢和解毒的双重作用在昆虫中主要有三种类型的共轭反应。第九十三张，PPT共一百零三页，创作于2022年6月1. 外来化合物或其代谢产物和内源性的活化供体反应 要求外来化合物或其它代谢产物有-OH， NH2， SH，-COOH基团，这些基团与尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）反应。-萘酚 + UDPG(活化供体)-萘基葡萄糖苷第九十四张，PPT共一百零三页，创作