分子生物实验课件：外周血单个核细胞总RNA的分离、纯化与RT-PCR

1、实验安排12月15日DNA重组技术（一）RNA提取、RTPCR12月21日DNA重组技术（二）电泳鉴定、纯化、连接12月22日DNA重组技术（三）感受态的制备、转化、培养1月5日DNA重组技术（四）重组质粒的提取、酶切鉴定实验要求1、掌握实验原理包括RNA提取、逆转录、PCR、琼脂糖凝胶电泳、克隆、感受态制备及重组DNA转化、重组子的筛选和鉴定2、正确书写实验报告包括原理、目的、仪器及试剂、步骤、结果（图片）、分析及讨论 实验一外周血单个核细胞总RNA的分离、纯化与RT-PCR实验目的1、掌握外周血单个核细胞的分离2、掌握单个核细胞中总RNA的提取纯化3、掌握逆转录的目的和原理单个核细胞的分离

2、：实验原理 单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells-PBMC）是血液中含未分叶核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞不同成分密度差异实验原理原理：trizol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此trizol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。氯仿虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。当溶液pH在酸性的时候，离心后DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在

3、水相。 trizol-氯仿一步法提取RNA抑制RNA酶活性的试剂焦磷酸二乙酯（DEPC)：一种强烈的烷化剂，能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶异硫氰酸胍：一种强蛋白变性剂，可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源性RNA酶活性实验原理 RT-PCR在真核细胞中，大多数基因含有大量的内含子，因此不易直接由基因组DNA直接克隆目的基因，需要提取RNA，并以Oligo（dT）或随机引物在逆转录酶的作用下，逆转录形成cDNA，在由cDNA 为模板PCR扩增出目的基因，并具有连续的氨基酸编码区实验原理1、外周血单个核细胞的分离 1）吸取2ml淋巴细胞分离液加入玻璃试管，

4、待用2）取抗凝血1ml，用1ml生理盐水混匀，然后沿管壁缓慢加入淋巴分离液上层 ，小心放入离心机，室温，离心2000rpm，15min3）用塑料吸管吸去最上层的血浆，再吸取单个核细胞层于一新的离心管中，加生理盐水5ml(至管口1cm)，混匀后离心，2500rpm，8min4）去上清，再次加生理盐水0.5ml，转入1.5ml的Ep管，2000rpm， 5min5）留细胞沉淀于Ep管用于下一步的总RNA提取实验步骤2、单个核细胞中总RNA的提取纯化：trizol-氯仿一步法1）在留有细胞沉淀的Ep管中一次加入500ul变性液trizol（吹打混匀）、100ul氯仿，置于漩涡混合器上混匀，冰浴15m

5、in2）412000rpm，离心15min，吸取上层水相转入Ep 管中，加等体积的异丙醇，-20，20min3） 412000rpm，离心15min，去上层异丙醇，加入500ul 70%乙醇进行洗涤。412000rpm，5min，倒去70%乙醇，留沉淀烘干。4）用10ul DEPC处理水溶解RNA，-20保存，用于逆转录实验步骤3、逆转录- RT-PCR 1)反应体系：25mM MgSO4 2ul样品总RNA 1.25ul随机引物 0.5uldNTP（各10mmol/L） 0.5ul2beast Buffer 5ulRnasin (20-40U/ul) 0.25ulDEPC处理水 补至 10u

6、l注：体系已配好，直接加入样品总RNA 3、逆转录- RT-PCR 2）反应条件：42 60min,905min, 45min1、去除外源RNase的干扰:操作要戴口罩，仪器用具要用0.1%DEPC水处理后灭菌；2、PBMC提取时，加入抗凝血，并且注意加入血液的方式，离心时试管要轻拿轻放；3、吸取单个核细胞时要注意不要吸取其它液层思考题1、总RNA提取的方法？2、逆转录的目的和原理 ？实验步骤 实验二PCR产物扩增、电泳鉴定、纯化与载体连接实验目的1、 PCR扩增目的基因、电泳鉴定2、DNA的胶回收实验3、掌握TA克隆的原理94-97 加热，DNA变性，双螺旋解开形成单链模板55 退火使引物与

7、单链DNA模板结合72 延伸在3端以dNTPs为原料在聚合酶催化下延伸，合成与模板互补的链。（变性-退火-延伸循环）实验原理2）琼脂糖凝胶电泳： agrose gel电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的DNA片段，在琼脂糖电泳中，DNA迁移的速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关如质粒开环DNA线性DNA共价闭合环状DNA 溴化乙锭（EB）能够嵌入到DNA分子的碱基对中形成荧光复合物，在紫外线激发下发射荧光 二、 实验原理3）T4DNA连接酶: DNA连接酶是一种封闭DNA链上的缺口的酶，借助于AT

8、P或 NAD+水解提供的能量，催化DNA的3-OH与5的磷酸基团生成磷酸二酯健。 T4DNA连接酶则连接双链DNA分子的粘性末端或平端。 二、 实验原理3）TA克隆：利用Taq酶在延伸过程中会在DNA的末端加A的特性，使PCR扩增产物和带T尾的载体在连接酶的作用下连接起来。三、实验步骤1、PCR 扩增目的条带（约650bp）1)反应体系：cDNA模板 5ul 特异性引物 （25uM） 2.0uldNTP（各10mM） 4.0ul2*Buffer(10) 5ul25mM MgSO4 3uldd H2O水 补至 50ul阴性对照：2）反应条件：94 5min94 45S65 30S72 30S72

9、 30SPCR产物于4 保存待用30 Cycle实验步骤电泳鉴定：1.配胶：取1g琼脂糖放入100ml的1*TAE缓冲液中，加热2min使溶化，冷却至600C后加入EB （5 l）至终浓度为0.5 g/ml,混匀2.将凝胶趁热导入先前准备好的胶板中，达到3-5mm厚。冷却至完全凝固3.取胶放入电泳槽，将产物与6*Buffer 混匀后，进样4.上样端接负极，另一端接正极，以5V/cm的电压开始电泳，30min5.取凝胶，观察三、实验步骤3、PCR产物纯化 1、按Binding Buffer/PCR产物=5：1比例加入Binding Solution B，颠倒混匀；（注PCR产物补至50ul）2、

10、把混合液转移到收集管的GenClean柱中，室温放置2min，8000rpm离心1min3、倒掉收集管中的废液，4、将GenClean柱重新放回收集管中，加500ul Wash Solution ，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液5、重复步骤4一次6、将GenClean柱重新放回收集管中，12000rpm离心1min,彻底去除Wash Solution 7、将GenClean柱放入新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30ul Elution Buffer或者水，室温或37放置2min8、12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。9、电泳检测回收

11、的DNA片段实验步骤4、与T载体连接PCR产物克隆试剂盒连接反应体系：PMD19-T载体 1ulSolution 5ul纯化的PCR产物 4ulFinal Volume 10ul16 连接过夜四、注意事项1、EB是强致癌物，注意操作安全；2、琼脂糖的浓度要根据分离鉴定的DNA的大小不同而配制不 同的浓度；3、DNA的纯度对酶切和连接很重要。五、思考题1、TA克隆的原理？2、T4连接酶与大肠杆菌DNA连接酶作用上有何区别 ？ 实验三 感受态细胞的制备、转化、培养1、掌握感受态细胞的制备2、掌握DNA转化过程3、掌握蓝白斑筛选的原理实验目的 什么是感受态？ 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细

12、胞才能大量的进行复制、增殖和表达。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态 怎么使细胞处于感受态？Cacl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于零度、Cacl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。宿主细胞基因（培养的菌株）表达端缺陷的-半乳糖苷酶突变体 外源载体lacz基因：编码肽链-互补 完整-半乳糖苷酶 X-gal和IPTG存在下生成蓝色物质X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷,半乳糖苷酶水解后生成的吲哚衍生物显蓝色IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，为非生理性诱导物，

13、可以诱导lacz基因表达一段-半乳糖苷酶的启动子编码肽链的区段一个多克隆位点(MCS)用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因MCS是外源DNA 的选择性插入 位点，一旦有外源DNA插到MCS中，lacz就发生插入突变，不能表达，X-gal将不能显蓝色，而形成白色菌落，肉眼可藉此分辨3233（一）感受态细胞的制备均需在冰上操作 1. 取菌液1.5ml于离心管中，冰浴5min后，4离心， 4000rpm,10min,去上清液，收集菌体。 2. 将0.5ml冰预冷的0.1mol/L Cacl2轻轻悬浮细胞，冰浴15min。 3. 4离心， 4000rpm,10min。 4. 弃上清，加入50

14、ul预冷的0.1mol/L Cacl2，小心悬浮细胞 5. 制备好的感受态细胞放冰上进行下步试验。34（二） 感受态转化 1 在上述Eppendorf管中加入10ul连接反应液，温和混匀（轻度摇晃），于冰上放置30min(Eppendorf管和移液器枪头要提前预冷）。 2 将上述混合物转移到预热到42的水浴锅中，热休克90s，然后将EP管迅速转移到冰浴，冷却1-2min. 3 向管内加入400ul的LB培养液，然后37100rpm振荡培养45min。 4 取100ul的转化细胞转移到含有Amp抗生素和X-gal的LB固体平板上，用灭菌棒涂布均匀。室温放置几分钟，然后倒置放入37度恒温培养箱过夜

15、，观察是否有菌落。351、转化实验必须在低温中进行，温度波动严重影响转化效率，所用的试剂均应冰浴，细菌保持在4以下；2、转化实验要做好对照，以检测感受态的细胞和重组质粒；以已知质粒转化感受态细胞做阳性对照；以TE缓冲也转化感受态细胞做阴性对照 实验四 重组质粒的提取、酶切鉴定1、掌握碱裂解法提取质粒DNA2、掌握质粒的酶切鉴定质粒DNA的分离碱变性法煮沸法SDS法羟基磷灰石层析法等各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性 法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化 碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构

16、和大小的差异进行分离提取的。 碱裂解提取质粒原理主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。SDS:十二烷基磺酸钠，是一种很强的阴离子表面活性剂，能破坏蛋白质分子结构溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4冰箱。溶液：0.2 mo

17、l/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1 SDS。溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。 EDTA的作用：DNA酶属于金属离子依赖酶，EDTA可螯合金属离子，使DNA酶失活，更有利于DNA的分离43 质粒DNA的酶切目的：限制性内切酶切割出目的DNA原理：利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。质粒DNA小量提取：一、收获1）在含相应抗生素（Amp）的LB中接入一单菌落，于37剧 烈振摇下培养过夜。2）将1

18、.5ml培养物倒入Ep管中，室温 8000rpm离心30s，收集菌体3）弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥二、碱裂解4）加100l用冰预冷的溶液(GTE缓冲液）中，旋涡振荡器剧烈振荡 5min。须确使细菌沉淀在溶液中完全分散。5）加200l新配制的溶液（NaOH-SDS）。盖紧管口，快速颠倒Ep管5-10次以混合内容物。不要振荡，将Ep管放置于冰上5min。6）加150l用冰预冷的溶液（乙酸钾溶液）。盖紧管口，温和颠倒数次使混匀，溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上5min。7） 4 12000rpm离心5min，取上清 （300ul左右）转移到另一Ep管中。8）加等体积体积异丙醇，振荡混匀，冰浴30min, 412000rpm离心10min,弃上清三、质粒回收9）用0.5ml预冷70%乙醇洗涤沉淀，静置2min, 412000rpm离心5min,弃上清，在空气中使核酸沉淀干燥10 min。（可用吹风机吹干）10）沉淀溶于20l TE（含RN