分子生物学检验技术：第十一章 单基因遗传性疾病的分子生物学检验

1、单基因遗传病的分子生物学检验Molecular Diagnosis for Monogenic Inherited Diseases遗传病分类 单基因遗传病 多基因遗传病 体细胞遗传病 染色体病 线粒体遗传病第一节 概述基因突变点突变 (Point Mutation)插入或缺失 (Indels)缺失或重复 (Deletion/Duplication)基因倒位 (Inversion)基因融合 (Fusion)动态突变 (Dynamic):不稳定三核苷酸重复序列，其突变是由于基因组中脱氧三核苷酸串联重复拷贝数增加，拷贝数的增加随着世代的传递而不断扩增 单基因遗传病分子生物学检验的策略直接诊断间接诊

2、断产前诊断静态突变点突变片段突变动态突变不同层次的检测方法DNA含量基因结构异常表达改变转录翻译直接诊断主要通过基因和DNA多态的连锁分析作出诊断。连锁分析是基于遗传标记与致病基因连锁，子代是否获得遗传标记间接地判断做出诊断。遗传标记是基因组中的DAN多态性位点，如RFLP，VNTR 等。间接诊断单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP) 第三代遗传标记芯片技术产前诊断产前诊断（prenatal diagnosis）在遗传咨询的基础上，通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行鉴别诊断，对患胎采用选择性流产，从而降低出生缺陷率，有助于提高优生质量和

3、人口素质。单基因遗传病是产前诊断的主要适应病种X连锁遗传病血友病A、B迪谢内肌营养不良脆性X综合征创伤性和非创伤性为主：羊膜腔穿刺（最常用）、绒毛取样（最常用）、脐血取样、胎儿镜及胚胎活检等超声波检查、母体外周血血清标志物和胎儿细胞检测等。血红蛋白病血友病 迪谢内营养不良症 脆性X综合症 成年型多囊肾第二节 血红蛋白病的分子生物学检验异常血红蛋白病 镰状细胞贫血(血红蛋白S病)；不稳定血红蛋白病；氧亲和力增高血红蛋白；血红蛋白M(家族性紫绀症) 镰状细胞贫血（SICKLE CELL ANAEMIA）1949 年世界上最早发现的第一个分子病，由此开创了疾病分子生物学。患者出生半年后，症状和体征逐

4、渐出现，生长发育不良，易发生感染。有贫血、黄疸和肝、脾增大，心、肺功能常受损，可发生充血性心力衰竭，甚至产生肌肉骨骼痛、腹痛等痛性危象。诊断：本病的诊断并不困难，重要的是要考虑到本病的可能性而不遗漏本病。根据种族和家族史、镰变试验阳性、血红蛋白电泳显示主要成分为HbS，再结合临床表现，即可明确诊断。实验室检查：1.外周血 血红蛋白为50100g/L。网织红细胞计数常在10%以上。红细胞大小不均，可见有核红细胞、靶形红细胞、异形红细胞。镰状红细胞并不多见，若发现则有助于诊断。通常采用“镰变试验”检查有无镰状细胞。2.骨髓象示红系显着增生，在再生障碍危象时增生低下，在巨幼细胞危象时有巨幼细胞变。3

5、.血清胆红素 轻中度增高，溶血危象时显着增高。本病的溶血虽以血管外溶血为主，但也存在着血管内溶血。4.血浆结合珠蛋白 降低，血浆游离血红蛋白可能增高。5.红细胞半衰期测定 显示红细胞生存时间明显缩短至515 天正常为(285)天。6.血红蛋白电泳 显示HbS 占80%以上，HbF 增多至2%15%，HbA2 正常，而HbA 缺如。 珠蛋白基因的第6位密码子由正常的GAG突变为GTG（AT），使其编码的珠蛋白N端第6位氨基酸由正常的谷氨酸变成了缬氨酸，形成HbS。这种血红蛋白分子表面电荷改变，出现一个疏水区域，导致溶解度下降。在氧分压低的毛细血管中，溶解度低的HbS聚合形成凝胶化的棒状结构，使红

6、细胞变成镰刀状。 ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA ATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA 已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探针，32P标记，

7、进行Southern Blot 杂交/斑点杂交。Normal Gene ProbeMutation S Gene ProbeASO探针诊断正常探针突变探针/ /S S/S斑点杂交结果正常 杂合子 纯合子珠蛋白生成障碍性贫血 分布最广和最严重的珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血 地中海贫血（常显）212112111211表型基因型正常人/静止型地中海贫血/轻型地中海贫血/HbH病/Hb Bart综合征/PCR是首选方案大范围缺失：Southern印迹地贫的基因诊断基因不同程度的缺失引起不同类型的地贫，基因缺失14个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个 Gene

8、时可得到10kb片段。BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe珠蛋白生成障碍性贫血 分布最广和最严重的珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血 珠蛋白生成障碍性贫血-珠蛋白生成障碍性贫血中发病率最高的类型 地中海贫血（常隐）地中海贫血珠蛋白基因位于11号染色体上突变-主要发病原因点突变-单核苷酸置换（主要）碱基的插入缺失（少见 ）中国人地贫突变位点与频率1PCR-RDB （反向点杂交）2PCR-ASO 3AS-PCR4基因芯片5突变寡核苷酸延伸扩增 反向点杂交同时诊断基因多个点突变M1 M2 M3 M4 M5 M6 正常探针突变探针 基因芯片技术 现在已经开发了多种诊断地贫的

9、芯片检测阅读系统，系统多采用国际先进的PCR体外扩增结合DNA芯片反向点杂交检测技术，可快速准确检测全血样本中珠蛋白基因上多个基因位点的突变 珠蛋白生成障碍性贫血的遗传咨询PCR-RFLP连锁分析技术珠蛋白基因5端有一限制性内切酶HgiA的多态性位点通过PCR扩增包括这一酶切位点在内的110bp片段用HgiA限制酶消化为65bp和45bp两个片段当父母均为杂合子时，则具有110bp、65bp及45bp三个片段结果判读待测胎儿若具有65bp和45bp二个片段，则为正常若有110bp、65bp和45bp三个片段， 则为珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者若仅110bp片段一条带，则为患儿 血友病是一种遗

10、传性出血性疾病。发病原因是由于患者的血液中先天缺乏某种因子，根据缺乏因子的不同分为三种类型：血友病甲（缺乏凝血因子V，又称血友病A）、血友病乙（缺乏凝血因子，又称血友病B）和血友病丙（缺乏凝血因子）。血友病A和血友病B均属X性联隐性遗传，一般由女性传递，男性发病。血友病丙较少见，为常染色体不完全隐性遗传，男女均可发病。通常所说的血友病是指血友病甲。第三节 血友病的分子生物学检验血友病F的基因结构 F基因位于X染色体长臂末端（Xq28），包括26个外显子和25个内含子，全长186kb 血友病的遗传方式和基因突变遗传方式：X连锁隐性遗传至1994年已报道F基因点突变174种，缺失117种，插入10

11、种。由于导致HA F基因的点突变多，故在实际工作中不可能对每一病人作点突变的检测，所以DNA多态性的连锁分析仍然是血友病基因诊断的常用手段。 FVIII基因倒位 （一）直接诊断：LD-PCR （二）间接诊断PCR-RFLP法 基因的非编码区DNA序列相对稳定，可以作为特定的多态性标志，如果某一致病基因与特定的多态性标志物紧密联锁，就可以利用该多态性标志物作为一种遗传标记，来诊断家系成员或胎儿基因组中是否携带该致病基因较常用作因子基因的多态性标志物有位于内含子18的Bcl内含子19的Hind 内含子22的Xba内含子13和22的CA二核苷酸重复序列(STR)肌营养不良症（muscular dys

12、trophies，MD）是一类常见的骨骼肌变性的遗传性疾病。临床表现为骨骼肌进行性萎缩和肌无力，主要累及肢体的近端肌肉，极少数累及远端肌肉，腱反射消失、肌肉假性肥大。分为多种类型（根据患者的临床表现、累及肌肉的分布、遗传方式等）假性肥大性肌营养不良（pseudohypertrophic muscular dystrophy）:最常见的肌营养不良，X连锁性隐性遗传病杜氏肌营养不良症 (Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)贝氏肌营养不良症(Becker Muscular Dystrophy，BMD)Emery-Dreifuss型肌营养不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy）肢-带型肌营养不良(limb-girdle muscular dystrophy）远端肌营养不良(distal muscular dystrophy）先天性肌营养不良(congenital muscular dystrophy）强直性肌营养不良(myotonic m