实验2培养基的配制、消毒与灭菌

1、实验二 培养基的制备 消毒与灭菌培养基配制实验原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质,用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个合适的营养条件。培养基配制要素营养：水分、碳源、氮源、生长因子和无机盐；适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力；水活度；氧化还原电位。培养基的分类根据微生物的种类和实验目的的不同，培养基分类可以按以下方式：1. 按成分的不同分2. 按培养基的物理状态分3. 按培养基的用途分按照培养基的成分来分天然培养基:主要成分是复杂的天然有机物质：如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、肉汤培养基等。合成培养基

2、:用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基：高氏一号培养基和査氏培养基等。半合成培养基：玉米培养基、豆芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基按照培养基的物理状态固体培养基：加入凝固剂，如1.5% 2.5%琼脂(m/v)半固体培养基：加入少量凝固剂，如 0.2% 0.7%琼脂液体培养基：不含任何凝固剂按照培养基的用途分基础培养基：如牛肉膏蛋白胨培养基。营养培养基（加富培养基）：如添加血清、血液等。鉴别培养基：用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊的化学物质，有些微生物在鉴别培养基上生长，会产生的一些代谢产物，能与这种化学物质反应，发生明显的特征性变化，根据这一变化，将这种微生物与

3、其它微生物区分开来。如伊红美蓝培养基。伊红美蓝培养基用于肠道菌群的分离鉴定。蛋白胨提供氮源、维生素和氨基酸乳糖为可发酵糖类伊红 Y 和美蓝抑制绝大部分革兰氏阳性菌的生长琼脂是凝固剂。大肠杆菌在 EMB 上发酵乳糖，形成有金属光泽的紫黑色菌落。沙门氏菌形成无色或浅蓝色菌落。金黄色葡萄球菌基本上不生长。 按照培养基的用途分选择培养基：利用微生物对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制杂菌的生长，而所需分离的微生物可以在培养基中生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。选择培养基如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生长；而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长；结晶紫能抑制革兰氏阳

4、性细菌的生长加富培养基：在普通培养基中加入特别适合某种微生物生长的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，使其形成生长优势，逐渐淘汰其它微生物，从而分离到该种微生物；从某种意义，加富培养基也是一种选择培养基。加富培养基P241附录II牛肉膏蛋白胨培养基的制备应用最广泛的细菌基础培养基牛肉膏： 3 g蛋白胨： 10 gNaCl： 5 g琼脂： 15-20 g水： 1000 mLpH： 7.47.6马铃薯培养基（PDA）的制备用来培养真菌马铃薯： 200 g蔗糖（葡萄糖） 20 g琼脂： 15-20 g水： 1000 mLpH： 自然马铃薯去皮，切成块煮沸30分钟，然后用纱布过滤；滤液中加入糖和琼脂

5、，溶化后补足水至1000 mL。高氏号培养基的制备用来培养放线菌可溶性淀粉： 20 gKNO3： 1 gNaCl： 0.5 gK2HPO43H2O： 0.5 g MgSO47H2O： 0.5 g FeSO47H2O： 0.01 g琼脂： 20 g水： 1000 mLpH： 7.27.4无氮培养基的制备用来培养固氮菌葡萄糖： 10 gKH2PO4： 0.2 g MgSO47H2O： 0.2 g NaCl： 0.2 gCaSO42H2O： 0.2 gCaCO3： 5 g琼脂： 20 g水： 1000 mLpH： 7.07.2豆芽汁培养基的制备用来培养酵母菌黄豆芽： 100 g蔗糖（葡萄糖）： 50

6、 g琼脂： 20 g水： 1000 mLpH： 自然称取新鲜黄豆芽100 g，放入烧杯中加水煮沸约30 min，用纱布过滤。滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至1000 mL，最后灭菌。麦氏（Meclary）培养基的制备用来培养酵母菌，利于酿酒酵母子囊孢子的形成葡萄糖： 1 gKCl： 1.8 g酵母浸膏： 2. 5 g 醋酸钠： 8.2 g 琼脂： 20 g水： 1000 mLpH： 自然玉米粒培养基（5406培养基）用来培养放线菌，观察孢子形成玉米粒： 50 g葡萄糖： 20 g碳酸钙： 2 g 酵母膏： 1 g 琼脂： 20 g牛肉膏： 2 g水： 1000 mL称取玉米粒50 g，加水煮

7、沸约30 min。加入其余成分和琼脂，溶化后补足水至1000 mL，最后灭菌。操作步骤称量溶化补足水分，调pH（过滤）分装6. 加塞7. 包扎8. 灭菌9. 搁置斜面10. 无菌检查称量药品时，严防药品混杂。称完一种药品后需要将牛角匙洗净、擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。药品不要弄错。如：K2HPO4和KH2PO4、水合形式和无水形式的化合物要注意分辨。培养基中多种无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。对于微量成分，可先配制成高浓度的储备液，按比例换算后再加入。琼脂溶化过程中，

8、要控制火力并不断搅拌，以免沸腾溢出或琼脂糊底烧焦。不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基。调pH值以前，先补足水分。pH值不要调过头，以免回调影响个离子浓度。固体分装：不超过试管高度的1/5；不超过三角烧瓶容积的一半为宜。分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免污染棉塞而引起污染。配好培养基后要贴上标签，写清培养基类型、组别、配制时间。培养基灭菌在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。配制培养基所用的营养物质、容器、环境中都含有各种微生物；微生物生长繁殖： 消耗养分 改变培养的酸碱度 产生毒素或者抑制物消毒与灭菌

9、消毒是一般指采用物理、化学和生物的方法消灭病原菌和有害微生物的营养体。灭菌则是杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子的过程。消毒与灭菌方法加热灭菌干热灭菌湿热灭菌过滤除菌辐射灭菌放射线辐照灭菌紫外线灭菌干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。干热灭菌有火焰灼烧灭菌、热空气灭菌以及电热灭菌。细胞内蛋白质的凝固性与其含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160170），时间要长（12h），但干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。高压蒸气灭菌高

10、压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽（0.05MPa）。排出灭菌锅中的冷空气，关闭排气阀，继续加热。由于水蒸气集聚，增加了灭菌锅内的压力（0.1MPa），从而使水的沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。高压蒸气灭菌一般培养基在0.1 MPa下，121维持1530 min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。其原因有三： 一、湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固； 二、湿热的穿透力比干热大； 三、湿热的蒸气有潜热存在。 1 g水在100时，由气态变为液态时可

11、放出2.26 kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。注意事项注意事项当含盐类的液体和含盐的琼脂中大量的盐类泼洒在工作腔体，要立即换水，冲洗腔体。否则它们会带来腐蚀和变质。灭菌结束时，要检查压力表上的指数为“0 Mpa”后才能打开锅盖。待灭物体不能堵塞通风孔，否则会引起装置故障，甚至爆炸。过滤除菌过滤除菌是通过机械作用滤去液体中微生物的方法。根据不同的需要选用不同的

12、滤器和滤板材料。过滤除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。紫外线灭菌紫外线灭菌是用紫外灯为光源。波长为200300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力弱，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯前，可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌；在无菌室内的桌面