分子生物学检验：单基因遗传病的分子诊断

1、单基因遗传病的分子诊断单基因遗传病致病基因：能够导致遗传病或者与遗传病发生相关的基因遗传方式：一对等位基因，常染色体遗传，X连锁遗传，Y连锁遗传，显性遗传，隐性遗传遗传性疾病分子诊断的策略一、直接诊断策略二、基因多态性连锁分析三、基因突变的定量（dosage）诊断 四、产前诊断定义：直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变类型： 点突变 缺失 插入 倍增前提：基因已经克隆，序列和结构清楚一、直接诊断策略一、直接诊断策略针对不同类型的突变，可以使用不同的方法进行检测，不同的方法可互补。目前，几乎所有类型的突变都有相应的方法检测到。一、直接诊断策略突变类型方法举例微小突变错义/无义突变剪接突变调控区序

2、列突变小缺失/插入基因测序，AS-PCR，PCR-RDBWilson病拷贝数变异简单拷贝复杂拷贝片段分析PCR; TP-PCR; TP-msPCR; msPCR脆性综合征大片段插入/缺失MLPA(连接酶依赖性探针扩增)Gap-PCRDMD; SMA;CMT1A复杂的重排长片段PCRHA血友病一、直接诊断策略二、基因多态性连锁分析检测原理：多态性连锁分析、关联分析检测前提： 致病基因尚未被定位和阐明 基因太大 突变种类太多检测方法：RFLP，STR，SNP三、基因突变的定量诊断检测内容：大范围的重复、缺失检测方法： 细胞分裂中期染色体检测 固相杂交 PCR 扩增方法分辨率(碱基数)说明细胞分裂中

3、期染色体检测染色体常规细胞培养至细胞分裂期染色；CGH5 x 106细胞分裂中期染色体作为探针来检测和控制不同的杂交；FISH5 x 104用修饰（如纤维探针）来增强分辨率；阵列CGH5 x 104使用阵列化的细菌人工染色体载体（Bacterial artificial chromosomes，BACs）而非细胞分裂中期染色体作为探针；MAPH不确定将探针与基因组DNA杂交，然后再扩增探针；微卫星PCR1 x 102取决于缺失区已知的微卫星；差异PCR1 x 102要求精心控制起始DNA的质和量，结果为相对量，是一种半定量方法；竞争PCR1 x 102准确，结果为摩尔数，是一种绝对定量方法；R

4、eal-time PCR1 x 102成本较高，可有多种方法如Taqman法或分子信标法的SYBR Green染料或探针，应用越来越广泛；长片段 PCR1 x 102检测基因内缺失比重复更有效，可以确定突变的性质。产前诊断是在遗传咨询的基础上，通过遗传学检测和影像学检查，对高风险的胎儿进行鉴别诊断，对患胎采用选择性流产，从而降低出生的缺陷率，有利于提高优生质量和人口素质。脐血（24-28周）、羊水（16-20周）或者绒毛组织（9-11周）母血污染的问题无创性产前诊断（NIPT, none invasive prenatal diagnosis）PGD(preimplatation geneti

5、c diagnosis) 单基因病遗传病的分子诊断一、血红蛋白病（hemoglobinopathy）二、血友病（hemophilia )三、肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)四、苯丙酮尿症(phenylketonuria)五、囊性纤维化(Cystic fibrosis)六、亨廷顿病(Huntington Disease)七、脆性X综合征(Fragile X syndrome) 血红蛋白病血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。 人类不同时期血红蛋白的组成胚胎

6、期血红蛋白：Hb Gower 1 （x2 e2 ）Hb Gower 2 (a2 e2)Hb Portland (x2 g2) 即Hb Portland 1另有少量Hb Portland 2 (x2 b2)，Hb Portland 3 (x2 d2)胎儿期主要血红蛋白：HbF （a2 g2 ） 成人主要血红蛋白：HbA （ a2 b2） 约占血红蛋白总量96.597.5%HbA2 （a2 d2 ） 约占血红蛋白总量2.53.5%HbF （ a2 g2） 约占血红蛋白总量1%以下结构异常血红蛋白病 镰刀状细胞贫血； 不稳定血红蛋白病 血红蛋白M病 氧亲和力改变地中海贫血， 珠蛋白的合成降低或消失血

7、红蛋白病（hemoglobinopathy） 1、镰刀形红细胞贫血正常细胞镰刀形细胞镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半，患者常因此缺氧窒息。N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链HbA 肽 链N-val his leu thr pro val glu C(146)镰刀状细胞贫血分子机制 GTG CAT CTG ACT CCT GAG GAGGTG CAT CTG ACT CCT GTG GAG分子诊断方法限制性内切酶法（RE）ASOARMS、跨越断裂点的PCR (裂口PCR、gap-PCR)S 肽链A肽链 AC

8、T CCT GAG GAGACT CCT GTG GAGRE法 (PCR-RFLP)DdeI C TNA G G ANT CASSA175268 443A肽链268 bp175 bp地中海贫血 地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一中国南方地中海贫血人群携带率Xu, et al. J Clin Pathol 2004, 57:517-22. Cai, et al. Chi J Epidemiol 2002,23:281-5. 病理和临床特征 地中海贫血的血液学表型特征RBC 参数 MCV MCH RDW Hb电泳分析 Hb A2 () 或 () Hb Barts （4） Hb H (4) Hb

9、 E () 地中海贫血基因学特征地中海贫血的共同特点：由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成，致使血红蛋白的组成成分改变。地中海贫血主要分为-地中海贫血和-地中海贫血。-地中海贫血-地中海贫血（简称-地贫）是一种由于-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病。多由-珠蛋白基因的缺失突变所致。16p13.33-p13.11 每条16号染色体上有两个Gene缺失程度不同，链合成部分或完全受到抑制，导致不同类型的地贫。 若一条染色体上缺失一个基因（ ）为+地贫，链合成减少。若一条染色体上两个基因均缺失（ ）为0地贫，链不能合成。地中海贫血地贫的不同类

10、型的基因缺失 -50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb (-SEA) Deletion （ ） (- 4.2) Deletion （ ） (- 3.7) Deletion （ ）2 1研究发现中国地区常见的3种 -地贫主要由 -SEA(东南亚缺失)、-3.7缺失(右缺失) 、 -4.2缺失(左缺失)引起。-地贫基因缺失示意图-a3.7-a4.2-SEA21211P1 P2P3 P4 -珠蛋白基因型PCR产物片段长度 - 3.72.0kb P2=P3 1.8kb P3=P4 - 4.21.6kb P1=P4-SEA1.3kb P1=P2非缺失型-地贫概念： -基因发生点突变或

11、少数几个碱基的缺失。中国常见的非缺失型突变：Hb CS 2 CD 142 TAACAA (Gln) Terminator mutation Hb QS 2 CD 125 CTGCCG (LeuPro) Unstable HbHb WS 2 CD 122 CACCAG (HisGln) Unstable Hb特点： 常发生于2基因，比缺失型导致更严重的珠蛋白链合成的减少。 a-地贫的基因型与表现型Normal (/) 正常+ thal trait (/-3.7)(/-4.2) 静止型单一基因缺失或丧失功能临床无任何症状，一般血液学检查无异样，仅平均红细胞体积(MCV) 位于正常值下限。a-地贫的

12、基因型与表现型Hb H disease (- 3.7/-SEA)(- 4.2/-SEA)o Thal trait ( /-SEA) ( - / - )血红蛋白H病3个基因缺失或丧失功能肝脾肿大，中度贫血。小细胞，低色素，HbH含量较高，易发生溶血，有些病例需不定期输血，症重者甚至需切除脾脏。 标准型2个基因缺失或丧失功能临床无症状，血液学检查出现轻微贫血，红细胞大小不均一，平均红细胞体积(MCV) 及平均红细胞血红蛋白量(MCH)明显偏低。a -地贫的基因型与表现型Hb Barts Hydrops (-SEA/-SEA) Hb Barts 水肿胎儿综合症 4个基因缺失或丧失功能患胎于妊娠晚期或

13、产后数小时内死亡，全身水肿，肝脾肿大。由于胎儿无法合成亚基，脐血血红蛋白（ Hb Barts ，4）含量高。a-地贫疾病严重程度的单倍型顺序a2a1T a2- - a1a2Ta1 -a1T - -纯合的-地贫基因型突变，为严重的HbH，偶可致胎儿水肿或者死亡-地中海贫血-地中海贫血是一种由于-珠蛋白基因突变导致肽链合成减少或缺乏而产生的单基因遗传血液病，多由-珠蛋白基因点突变所致。 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42M， -28M， IVS-II-654M，CD71-72M等。 1115.5EXON 1IVS 1 EXON 2EXON 3 IVS 2Promoter mutationR

14、NA splicing Initiation mutationFrameshiftNonsense Poly(A) signal 地中海贫血的点突变b-地贫的基因型与表现型 重型-地中海贫血所有患者有组织缺氧症状，可出现“地中海贫血面容”，生长发育迟缓。红细胞体积小且低色素。过剩的游离链形成链包涵体，引起溶血性贫血，靠输血维持生命。/ 、0/ 0 、0/ （纯合子或双重杂合子） 轻型-地中海贫血患者症状较轻，轻度贫血，轻度肝脾肿大。红细胞脆性降低，小细胞，低色素，MCV、MCH较低。/ 、/ 0 （杂合子）b-地贫的基因型与表现型 中间型-地中海贫血患者临床症状介于重型和轻型之间，如中度偏重贫

15、血，生长发育迟缓，黄疸等。血液检查呈小细胞低色素贫血症。/ 、/ 0 （纯合子或双重杂合子）筛查的方法血常规MCV，MCH，RDWHb typingHbA2（血红蛋白电泳，HPLC）基因诊断Gap-PCR反向斑点杂交Gap-PCR原理Location of primers and detection of -SEA deletion by gap-PCR-地中海贫血基因诊断结果判读M. DNA Marker1. 未发生- 3.7、- 4.2、-SEA缺失2. 发生- 4.2缺失 杂合子3. 发生- 3.7缺失 杂合子4. 发生- 4.2缺失、-SEA缺失5. 发生- 3.7缺失、-SEA缺失6

16、. 发生-SEA缺失 杂合子 M 1 2 3 4 5 6 M -珠蛋白基因型PCR产物片段长度 - 3.72.0kb 1.8kb - 4.21.6kb-SEA1.3kb注：反向点杂交技术膜条显色原理生物素链霉亲和素-过氧化物酶复合物TMBH2O2固定在膜上的探针-地中海贫血基因诊断结果判读41-42N654N28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M28M71-72M17MEM31MIVS1-1M43M32M29M30M14-15MCAPMIntMIVS1-5M发生654M、71-72M点突变 双重杂合子发生17M点突变 杂合子发生EM点突变 纯合子发生41-42M点突

17、变 杂合子-地中海贫血点突变基因诊断结果判读未发生 QS、 CS、 WS点突变发生 WS点突变 杂合子发生 CS点突变 杂合子发生 QS点突变 杂合子 注： 纯合子、杂合子，需结合-地中海贫血缺失型的结果来判断地中海贫血的产前诊断意义针对的人群标本的来源绒毛 羊水 脐血 宫颈脱落细胞 孕妇外周血胎儿细胞 外周血胎儿DNA什么是综合诊断？综合诊断的必要性？地中海贫血的综合诊断血友病一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血, 分为A,B,C三种。1.血友病A（血友病甲），即因子促凝成

18、分（：C）缺乏症，也称AGH缺乏症，是一种X连锁隐性遗传疾病，女性传递，男性发病。2.血友病B（血友病乙），即因子缺乏症，又称PTC缺乏症、凝血活酶成分缺乏症，亦为X连锁隐性遗传，其发病数量较血友病A少。但本型中有出血症状的女性传递者比血友病A多见。3.血友病C（血友病丙），即因子（F）缺乏症，又称PTA缺乏症、凝血活酶前质缺乏症。为常染色体不完全隐性遗传，男女均可患病，是一种罕见的血友病。临床表现1.出血（重型，中间型，轻型，亚临床型）2.血肿的压迫分子基础1.血友病AF基因的缺陷导致F合成的障碍以及F分子结构的异常引起F功能活性的降低或缺乏F基因位于X染色体长臂末端(Xq28) 包含186kb，约占X染色体全长的0.1%。外显子26个，总长度约9kb。内含子25个。mRNA长约9029bp,，引起血友病甲的F基因缺陷可以是点突变、基因的部分或全部缺失、基因成分插入、产生终止密码的点突变和基因倒位。50%由于基因的倒位引起。诊断方法F功能活性的检测LD-PCR,测序2.血友病BF 基因的缺陷导致F 合成的障碍以及F 分子结构的异常引起F 功能活性的降低或缺乏。绝大